基于高通量测序的鸡粪堆肥过程细菌群落结构分析

张 慧 林戎斌 林陈强 贾宪波 苏光秋 陈济琛

（1福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建福州 350001；2屏南县农业农村局，福建屏南 352300）

随着畜禽养殖业的高质量发展以及环境保护政策的实施，禽畜粪便等农业废弃物的资源化、无害化处理[1-2]，有利于减少禽畜粪便随意排放造成的污染，如何实现禽畜粪便的回收再利用、变废为宝成为研究的热点之一[3-5]。禽畜粪便通过堆肥发酵处理将其中的致病菌和寄生虫杀死，得到高品质的腐殖质，可为植物和土壤提供肥料，有利于可再生能源的发展[6]。近年来，Illumina 测序平台Solexa 高通量测序技术逐渐被应用于堆肥微生物种群结构与演替规律的相关研究，Antunes 等[7]对高温堆肥过程的宏基因组和基因转录组结果的分析表明，堆肥过程中表现出持续的嗜热谱（50～70 ℃），在高温阶段真菌活性近乎消失。黄家庆等[8]利用高通量测序技术对猪粪堆肥的研究发现，猪粪堆肥添加生物炭后，堆肥物料理化性质发生了改变，生物炭为堆肥细菌提供了合适的生长环境。Yan 等[9]采用高通量测序技术分析了堆肥稻草中固态厌氧发酵产气过程中微生物种群信息，结果表明，微生物种群主要由甲烷杆菌属、拟杆菌纲、梭菌和变形菌门细菌组成。

本研究利用高通量测序技术分析鸡粪和菇渣堆肥过程中的细菌群落结构变化及演替规律，深入探讨细菌在鸡粪堆肥过程中的作用，为畜禽粪便资源化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 堆肥原料和样品采集

堆肥发酵在福建省某公司厂内进行，鸡粪来自尤溪，菌渣来自顺昌，鸡粪和菌渣按质量比4∶6 均匀混合，初始含水率为60%～65%，碳氮比（C/N）为29∶1（表1），槽式堆肥规格为80.0 m×5.0 m×1.5 m（长×宽×高），通过翻堆进行通气，每3 d翻2次，每日监测环境和堆体温度。槽式堆肥发酵持续30 d，在第1、2、7、20 和30 天分别从堆体上、中、下层进行取样，每层取5 个样点，均匀混合，分别记作FJ0、FJ1、FJ2、FJ3和FJ4。堆肥样品分2 份，一份500 g 放置实验室4 ℃保存，另一份100 g 放置-80 ℃保存，分别用于理化指标测定和高通量测序分析。

表1 堆肥原料理化参数

1.2 堆肥样品理化指标测定

堆体温度和空气环境温度利用数显温度计测定；含水率采用恒重法测定；pH采用电位法测定；总有机碳和全氮分别采用重铬酸钾容量法和硫酸双氧水消煮—凯氏定氮法测定；总有机碳和全氮两者的比值为碳氮比。

1.3 堆肥样品DNA提取和高通量测序

使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取堆肥样品细菌总DNA，用NanoDrop超微量紫外分光光度计测定总DNA的浓度和纯度，以浓度和纯度均较高的总DNA为模板，用引物338F和806R进行细菌16S rRNA基因的PCR扩增。PCR扩增体系：10 ng DNA模板，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.8 μL引物，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，4.0 uL 5×FastPfu 缓冲液。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s；72 ℃延伸60 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。使用Universal DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，纯化产物由上海美吉生物公司利用Miseq PE300 平台进行高通量测序。

1.4 生物信息学分析

基于Illumina 分析平台对原始测序数据进行过滤处理，去除OTU 单序列和嵌合体序列得到优化序列，进行序列对比，在相似度97%水平上进行OTU聚类，有效序列信息物种采用RDP 分类器软件进行分类学分析，同时对堆肥样品进行α多样性相关分析，多样性指数包括ACE、Chao1、Shannon、Coverage和Simpson等。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中的理化性质变化

温度是堆肥过程中重要的评价指标之一，是影响堆肥腐熟的关键因素。从图1 可以看出，堆肥开始后，堆体温度逐渐上升，第7 天温度最高，达到68 ℃，而后逐渐下降，达到环境温度时基本稳定。堆肥过程中堆体温度变化可以分为4 个时期：升温期（第1—2天），高温期（第3—15天），降温期（第16—20 天）和腐熟期（第21—35 天）。由表2 得知，随着堆肥不断进行，含水率、pH 值和总有机碳含量呈下降趋势，全氮含量则为上升趋势。

图1 堆肥过程中温度的变化

表2 堆肥过程中堆肥样品的理化参数变化

2.2 堆肥过程中细菌群落丰度和多样性

堆肥样品的DNA 序列结果在NCBI 上的登录号为PRJNA678850。堆肥样品细菌16S rDNA V3—V4区测序过滤后，有效序列数为40 741～59 781 条，OTUs数为312～720条，在97%相似水平下聚类统计，得到各个堆肥样品OTU中的丰度信息。ACE指数和Chao1指数代表细菌菌群丰富度，指数值越大说明丰富度越高[10]；Simpson 指数反映细菌群落优势度，指数值越大细菌群落多样性越低[11]；Shannon 指数也是反映各堆肥样品多样性的指数之一，多样性程度随数值增大而升高。由表3可知，5个堆肥样品物种覆盖率指数在0.991 2～0.996 7，ACE指数和Chao1指数随着堆肥温度升高而增大，指数值在高温期最大，随着堆肥温度降低指数值有所减小；Simpson指数随着温度升高而减小，指数值在高温期最小；Shannon指数值在高温期最大，说明在堆肥过程中，高温期堆肥中细菌菌群丰富度最高，群落多样性最大。

表3 堆肥样品细菌多样性指数

2.3 堆肥体系中细菌群落在门和纲水平上的分布

如图2所示，在细菌门水平上，鸡粪堆肥过程中主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、盐厌氧菌门（Halanaerobiaeota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）等，相对丰度之和占到总量的93%以上，其他细菌相对丰度占比均低于1%。其中，厚壁菌门是好氧堆肥过程中木质纤维素降解的主要菌群[12]，可以促进纤维素的降解和利用。厚壁菌门的相对丰度在鸡粪堆肥各时期均占主导地位，可能与其孢子的耐热性有关[13]，其在腐熟期的相对丰度最高，较堆肥当天升高了1.21倍，随着堆肥温度变化先降低后升高，对菌渣的降解具有重要作用；拟杆菌门具有降解高分子量化合物的作用[14-17]，其在腐熟期相对丰度最低，在堆肥当天最高；盐厌氧菌门是一类兼性厌氧菌[15，18-19]，在降温期相对丰度最高，比堆肥当天升高16.92倍。

图2 堆肥体系中主要的细菌门及相对丰度

如图3所示，在纲水平上，鸡粪堆肥过程中主要有梭菌纲（Clostridia）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、Limnochordia、盐厌氧菌纲（Halanaerobiia）、Thermovenabulia 和放线菌纲（Actinobacteria）等细菌，相对丰度之和占到总量的95%以上，其他细菌相对丰度占比均低于1%。其中，芽孢杆菌纲细菌可以分解蛋白质，在升温期和高温期相对丰度较低，腐熟期相对丰度最高，较堆肥当天升高7.01 倍；梭菌纲细菌在升温期相对丰度达到最高，比堆肥当天升高2.30倍，之后逐渐降低；拟杆菌纲细菌在腐熟期相对丰度最低，在堆肥当天最高；盐厌氧菌纲细菌在降温期相对丰度最高，Limnochordia是耐中高温的兼性厌氧菌，在高温期相对丰度最高。

图3 堆肥体系中主要的细菌纲及相对丰度

2.4 堆肥样品属水平细菌群落聚类分析

对样品间OTUs 分析，将相对丰度排名前50 的细菌属双向二维聚类，在图4 中颜色的梯度及相似程度可以清楚获知样本间细菌相对丰度的变化，颜色逐渐加红代表细菌属的相对丰度逐渐升高，颜色逐渐加蓝代表细菌属的相对丰度逐渐降低。图4中5 个堆肥时期样品可以分成2 个大类，FJ0细菌群落结构与其他堆肥时期样品细菌群落结构有显著差异，FJ0单独为一类，FJ1、FJ2、FJ3和FJ4细菌群落结构较相似聚为一类，说明经过发酵，堆肥细菌类群发生变化，但在发酵过程中，堆肥细菌类群较类似。

图4 堆肥样品属水平细菌的OTUs聚类分析热图

3 结论与讨论

本试验通过高通量测序分析发现，在鸡粪堆肥过程中细菌群落是不断演化的。α多样性相关分析表明，高温期堆肥中细菌菌群丰富度最高，群落多样性最大，说明在此阶段细菌群落代谢活动最旺盛，高温期是有机质腐化最快的时期，对堆肥物料转化起作用的微生物数量和种类迅速增加[20]，微生物的代谢活动加速了堆体升温，延长了高温期，充分利用微生物以提高堆肥腐熟度对好氧堆肥具有重要意义。在细菌纲水平上，鸡粪堆肥过程中主要有梭菌纲、芽孢杆菌纲和拟杆菌纲等；在细菌门水平上，鸡粪堆肥过程中主要有厚壁菌门、拟杆菌门和盐厌氧菌门等。厚壁菌门具有纤维素降解作用，其相对丰度在鸡粪堆肥各时期均占主导地位，这与王建才等[12]的研究结果一致，其在腐熟期的相对丰度最高，随着堆肥温度变化先降低后升高，说明厚壁菌门对菌渣的降解具有重要作用，外源加入此类菌群能否加快物料降解与腐熟，有待进一步研究。

本研究利用高通量测序技术分析了鸡粪和菇渣堆肥过程中的细菌群落结构变化及演替规律。结果表明，在鸡粪堆肥期间细菌群落结构随发酵时间延长发生变化；其中高温期堆肥中细菌菌群丰富度最高，群落多样性最大；厚壁菌门为鸡粪堆肥各阶段的主要类群。