炎症性肠病合并皮肤损害患者外泌体差异表达蛋白质及发病机制研究

吴俊俊 李珍 李华铭 李春霞 朱伟琴 王宇芳

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，是常见的慢性消化系统疾病之一。IBD 可发生在肠内，也可发生在肠外，可能涉及多种器官系统，包括关节、皮肤、眼睛、肝脏、胆汁、肺、肾、免疫系统或血液系统等。胃肠道外器官的累及通常称为IBD 的肠外表现，其发病率高达6%～47%[1]。近10 年来，关于外泌体与IBD 关系的研究较多，但其与IBD 合并皮肤损害关系的研究较少。目前，临床上对于合并皮肤损害的IBD 诊断存在延误现象，部分患者在IBD 诊断前就已经出现皮肤损害，部分患者在IBD 诊断后出现皮肤损害。而诊断的延误会导致治疗的延误，使患者的生活质量降低，并造成更大的经济负担。因此，迫切需要研究新的靶点来进一步阐明该病的发病机制，为临床精准治疗提供方向。外泌体携带着大量细胞特异的生物活性分子，如核酸、蛋白质、脂类和糖类等，通过囊泡运输和向受体细胞运送蛋白质和核酸来调节多种病理生理途径，在机体免疫调节、动脉粥样硬化、肿瘤药物抵抗、抗病毒等多种生理病理过程中发挥着重要作用[2]。近年来学者发现，M2B 巨噬细胞衍生的外泌体通过C-C 基序趋化因子1（C-C chemokine 1，CCL1）/CCR8 轴上调调节性T细胞和IL-4 的水平，下调结肠炎相关细胞因子IL-6、IL-1β、和IL-17A 的水平，从而减轻诱导性结肠炎的严重程度[3]。在英夫利昔单抗治疗IBD 的研究中，使用蛋白质组学技术检测出了差异表达蛋白质，为临床治疗提供了更多依据[4]。通过质谱分析蛋白质组学适用于分子机制的研究，利用串联质量标签（tandem mass tags，TMT）的MS/MS 蛋白质组学策略已成为蛋白质组学研究中的一个重要策略，有助于鉴别并定量差异表达蛋白质。因此，本研究基于TMT 蛋白质组学分析IBD 合并皮肤损害患者的外泌体，进一步阐明IBD 合并皮肤损害的发病机制，为其临床诊断、靶向治疗、预后转归判断等提供依据，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取杭州市第三人民医院2020 年1 月至2021 年12 月 收 治 的5 例IBD 以及5 例IBD 合并皮肤损害患者为研究对象，分别为IBD 组、IBD+皮肤损害组；另选取本院同期体检的5 名年龄和性别匹配的健康志愿者为对照组。IBD 组男2 例，女3 例；年龄22～66（50±17）岁。IBD+皮肤损害组男3 例，女2 例；年龄48～64（61±8）岁；IBD 合并荨麻疹2 例，IBD 合并湿疹2例，IBD 合并多形红斑1 例；皮肤损害主要表现为皮疹、瘙痒，部分有脱屑。对照组男3 人，女2 人；年龄49～62（56±5）岁。3 组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：KL2018031），所有患者知情同意。

1.2 血清外泌体提取 采集入组对象清晨空腹肘静脉血5 mL，4 ℃2 000 r/min离心10 min，取上清液于1.5 mL无RNA酶EP管中，-80 ℃冰箱储存备用。将-80 ℃样品进行解冻，4 ℃13 500 r/min 离心15 min，取上清液，经0.22 μM微孔滤膜过滤，使用Exo Quick Solution 外泌体提取试剂盒从血清中分离外泌体。

1.3 血清外泌体差异表达蛋白质鉴定 采用BCA 法对外泌体蛋白质进行初步定量。加入蛋白酶抑制剂及尿素溶液（终浓度为8 mol/L）后，利用超声进行裂解，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。在蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5 mmol/L，56 ℃还原30 min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11 mmol/L，室温、避光孵育15 min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2 mol/L。按1∶50 的质量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，37 ℃酶解过夜。再以1∶100 的质量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，继续酶解4 h。用0.5 mol/L TEAB 溶解肽段，根据TMT 试剂盒操作说明标记肽段；使用高pH 反向HPLC 分离肽段，色谱柱为Agilent 300Extend C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相梯度为8%～32%乙腈，60 min 分离60 个组分；随后将肽段合并为14 个组分，真空冷冻干燥。肽段用液相色谱流动相A 相0.1%（v/v）甲酸水溶液溶解后，使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。分离出的肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI 离子源中进行电离，再进行Q Exactive Plus 质谱分析。数据采集模式使用数据依赖型扫描程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20 肽段母离子依次进入HCD 碰撞池使用28%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。

1.4 差异表达蛋白质的生物信息学分析 采用基因本论（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对IBD组与IBD+皮肤损害组差异表达蛋白质进行生物信息学分析。（1）GO 主要用于表述基因和基因产物的各种属性分析，能从不同角度阐释蛋白质的生物学作用，主要包括生物进程、细胞组成和分子功能等。（2）KEGG 是一个集合基因组、系统功能信息和化学的综合性数据库，主要用于基因组及其功能的系统分析，主要包括代谢通路、复合物、生化反应等。

2 结果

2.1 血清外泌体差异表达蛋白质的鉴定 通过质谱分析共得到二级谱图416 950 张，可利用的有效谱图36 899 张，谱图利用率为8.8%。通过谱图解析鉴定肽段8 412 条，其中特异性肽段7 860 条。本研究共鉴定829 种蛋白质，其中包含定量信息的蛋白质726 种。与对照组比较，IBD 组有15 种蛋白质表达上调，21 种蛋白质表达下调，见图1A；IBD+皮肤损害组有24 种蛋白质表达上调，25 种蛋白质表达下调，见图1B；与IBD 组比较，IBD+皮肤损害组有12 种蛋白质表达上调和8 种蛋白质表达下调，见图1C。

图1 差异表达蛋白质的火山图（A：IBD 组比对照组；B：IBD+皮肤损害组比对照组；IBD+皮肤损害组比IBD 组）

2.2 差异表达蛋白质的GO 分析结果 GO 分析显示，IBD 组与对照组、IBD+皮肤损害组与对照组、IBD+皮肤损害组与IBD 组差异表达蛋白质涉及的生物过程包括刺激反应、细胞过程、单有机过程、生物调节等，细胞组成主要包括细胞、细胞膜外域、细胞器等，分子功能主要包括结合、催化活性等，见图2。

图2 差异表达蛋白质的GO 分析结果（A：IBD 组比对照组；B：IBD+皮肤损害组比对照组；C：IBD+皮肤损害组比IBD 组）

2.3 差异表达蛋白质的KEGG 分析结果 KEGG 分析显示，IBD 组与对照组差异表达蛋白质主要与细胞黏附、离子跨膜运输调控、细胞形态分化等有关；IBD+皮肤损害组与对照组差异表达蛋白质主要与细胞分泌、细胞分解代谢、分泌调节有关；IBD+皮肤损害组与IBD组差异表达蛋白质主要与细胞胺代谢、NIK/NF-κB 信号通路、细胞周期过程的负调控等有关，见图3（插页）。

图3 差异表达蛋白质的KEGG 分析结果（A：IBD 组比对照组；B：IBD+皮肤损害组比对照组；C：IBD+皮肤损害组比IBD 组）

3 讨论

随着蛋白质组学分析技术的不断提高，IBD 发病机制研究也在不断深入，这为临床精准治疗提供了新的方向。本研究结果发现，与对照组比较，IBD 组有15种蛋白质表达上调，21 种蛋白质表达下调；IBD+皮肤损害组有24 种蛋白质表达上调，25 种蛋白质表达下调；与IBD 组比较，IBD+皮肤损害组有12 种蛋白质表达上调和8 种蛋白质表达下调。考虑到这些蛋白质表达的差异性可能在IBD 合并皮肤损害的发病机制中起着重要作用，故本研究利用生物信息学技术对这些差异表达蛋白质作进一步分析。IBD 的发病机制较为复杂，包括环境因素、遗传易感性、基因和免疫因素等多个方面[5-7]。IBD 合并皮肤损害的患者会表现出不同于肠内病变的病理学改变，可能是因为中性粒细胞功能异常或细胞免疫功能受损所致的。本研究GO 分析发现，与IBD 组比较，IBD+皮肤损害组外泌体蛋白质在刺激反应、细胞过程及单有机过程等方面有着丰富的生物学功能，与目前临床上对IBD 病理及生理学认识是一致的。KEGG 分析发现，与IBD 组比较，IBD+皮肤损害组外泌体蛋白质在细胞胺代谢、NIK/NF-κB 信号通路、细胞周期过程的负调控等方面有着丰富的生物学功能。某研究对结肠炎动物模型进行蛋白质组学分析发现，通过激活AMPK/核因子红系2 相关因子2/血红素加氧酶-1 通路可抑制高迁移率族群1/NF-κB级联，增强结肠黏膜细胞的自噬和抑制凋亡，减轻结肠炎症反应[8]。促炎细胞可通过激活NK-κB 信号通路，进而激活一系列与免疫相关的基因。在多数细胞中，TNF 也可以杀死细胞，但NK-κB 的激活可以阻止TNF 诱导的细胞死亡[9]。TNF 是一种促进炎症反应并参与IBD 发病的细胞因子，与其他细胞和组织不同的是，肠上皮细胞在暴露于TNF 后会发生快速的细胞死亡，其具体机制尚不清楚。相关实验证实，TNF 介导的慢性IBD 的发病机制具有重要临床意义[10]，目前通过抗TNF 治疗IBD 也取得了良好的疗效[11-12]。肠黏膜的另一个关键性调控信号通路是Wnt/β-catenin 信号通路，它在维持上皮干细胞功能中发挥关键作用[13]。与IBD 组比较，本研究生物信息学分析显示的IBD+皮肤损害组外泌体差异表达蛋白质的生物学功能与蛋白质结构是一致的，这或许可以解释IBD 合并皮肤损害患者自身免疫因素的重要性。从细胞学角度分析，维持细胞膜稳定性也是非常重要的，这或许为将来靶向研究提供了方向。

综上所述，本研究基于TMT 蛋白质组学分析筛选出IBD+皮肤损害患者血清外泌体差异表达蛋白质，这些蛋白质参与IBD 合并皮肤损害的代谢相关通路及生物学功能。