大豆卵磷脂对湖羊精液4 ℃保存效果的影响

江才雨，康言，王旭洋，李拥军

(扬州大学动物科学与技术学院/江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏 扬州 225009)

人工授精技术可以提高优良公畜种质资源的利用率，防止精液的浪费，提高繁殖效率[1]。精液保存则是人工授精技术中的重要环节，精液保存方法分为液态保存与冷冻保存。冷冻保存技术可使优质公畜的精液得到长期保存，但与猪和牛相比，绵羊精液解冻后的精子活力、活率分别下降到30%和40%[2]。这是由于绵羊精液对超低温耐受能力更差，对温度变化更加敏感。相对于精液冷冻保存技术，液态(4 ℃)保存方法在温度上对精液造成的损害较小，可逐渐减弱精子代谢机能和活动力，从而延长精子存活时间[3]。因此，采用4 ℃保存方法进行人工授精是一种较为直接、有效的方法。

为确保在低温环境下精子能够存活更久，在稀释液中添加抗冻保护剂可以延长精子的存活时间并维持其较好的受精能力[3]。大豆卵磷脂(SL)是磷脂酰胆碱(PC)和几种脂肪酸的天然混合物，可以替代卵黄中的高密度脂蛋白和磷脂，还可以预防或改善精液在冷藏和冷冻保存过程中精子质膜的损害[4]。有研究表明，在常规精液稀释液中添加SL能够在4 ℃有效提高猪精子的活力、有效存活时间、总存活时间和质膜完整性，其中0.6 g/L SL的添加效果最优[5]。然而，目前有关SL在湖羊精液4 ℃保存的研究鲜见报道。因此，本文通过研究在湖羊精液基础稀释液中添加不同浓度的SL，检测精子活率、活力、质膜完整率和顶体完整率等指标，分析SL对湖羊精液4 ℃保存效果的影响，以期筛选出适宜浓度的SL，为今后湖羊精液低温保存技术在实际生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验所选用的3只健康成年湖羊来源于扬州大学实验羊场，年龄为2～3岁，体格健壮，无任何疾病且繁殖性能优良。每日饲喂2次精饲料和草料。圈养，自由饮水。

1.2 主要试剂与仪器

柠檬酸钠(纯度≥99.5%，货号为S11111)，青霉素钠(货号为S17030)和链霉素硫酸盐(货号为S17085)，均购自上海源叶生物科技公司；SL(纯度≥60%，货号为A510030-0100)，考马斯亮蓝G-250(货号为C8420)，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；4%多聚甲醛(货号为E672002)，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；85%磷酸(货号为10015418)，95%酒精(货号为10009218)，均购自国药集团化学试剂有限公司；迈郎精子全自动分析系统(CASA)(型号为ML-608JZII)，购自南宁松景天伦生物科技有限公司。

1.3 稀释液配制

使用电子天平准确称量果糖0.5 g，柠檬酸钠2.4 g，青霉素钠0.031 2 g和链霉素硫酸盐 0.069 4 g，充分溶于100 mL超纯水，用0.22 μm过滤器过滤除菌，配制成基础稀释液。在基础稀释液中添加不同浓度(0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)的SL，然后放置4 ℃冰箱保存备用，于采精前1 h放入恒温水浴锅中预热。

1.4 精液采集与稀释

采用假阴道法采集公羊精液，将精液置于37 ℃保温杯中，并在30 min内带回实验室进行精液质量检查，要求气味略带腥味，颜色为乳白色，密度适中，且精子活率达到80%以上则可用于试验。将检测合格的精液混合并与不同浓度SL的稀释液按1∶9的比例进行等温稀释，用多层脱脂棉包裹置于4 ℃冰箱。在精液保存期间每隔24 h检测精子活率、活力、运动性能、质膜完整率和顶体完整率等指标。

1.5 精液品质检测

1.5.1 精子活率、活力及运动性能测定

精液置37 ℃水浴锅中孵育3 min，缓慢混匀，抽取1.8 μL精液滴在精子计数板上，采用CASA随机采集5个视野，对精子活力、活率、直线速率、曲线速率和路径速率等运动参数进行检测。

1.5.2 质膜完整性检测

低渗肿胀试验(HOST试验)用于评估精子膜的质膜完整性。当精子在低渗环境中，水分子会通过精子质膜进入膜内而导致精子尾部体积变大而膨胀弯曲，这是精子质膜完整的标志[6]。低渗溶液的配制：称取0.49 g柠檬酸钠，0.9 g果糖，用100 mL灭菌超纯水充分溶解。检测时，取10 μL精液与100 μL低渗透溶液在离心管中均匀混合，放置37 ℃水浴锅中孵育30 min后，取1 μL处理过的精液滴于计数板上，在油镜下用Smart数字成像系统进行观察，采集10个不同视野下的图像，每个视野至少计数200个精子，计算弯尾精子百分率，即质膜完整率。

1.5.3 顶体完整性检测

使用考马斯亮蓝G250染色法评估精子顶体完整性。取50 μL精液置离心管中，加入1 mL 4%多聚甲醛固定液吹打混匀，固定10 min，在离心机中2 000 r/min离心5 min，弃上清液，缓慢吹打剩余沉淀，取10 μL处理过的精液滴加到载玻片上制成抹片，晾干，用考马斯亮蓝染液染色30 min，水洗，风干。在油镜下用Smart数字成像系统进行观察，采集15个不同视野下的图像，每个视野至少计数200个精子，统计顶体完整率。

1.6 数据统计与分析

采用Excel 2021软件整理试验数据，然后运用SPSS 26.0软件对所得试验数据进行单因素方差分析。结果均以“平均值±标准差”表示。每组数据设3次重复，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 低温保存下不同浓度SL对湖羊精子活率和活力的影响

由表1和表2可知，精子活率、活力随着精液保存时间的延长均呈缓慢下降的趋势。与其他SL处理组相比，0.1% SL组的下降趋势最为缓慢。保存1 d，0.1%、0.2% SL组的精子活率、活力均显著高于其他组(P<0.05)；保存2、5、6 d，0.1% SL组的精子活率、活力均显著高于其他4组(P<0.05)；保存4 d，0.1%、0.2%和0.3% SL组的精子活率和活力均显著高于其他2组(P<0.05)。

表1 不同浓度SL对低温保存湖羊精子活率的影响 %

表2 不同浓度SL对低温保存湖羊精子活力的影响 %

2.2 低温保存下不同浓度SL对湖羊精子运动性能的影响

由表3可知，在4 ℃时，随着保存时间的延长，精子的直线速率、曲线速率和路径速率均呈逐渐下降趋势，其中0.1% SL组下降较为平缓。保存1、2 d，0.1%、0.2% SL组以及对照组的精子直线速率显著高于其他2组(P<0.05)；保存3 d，0.1% SL组的精子直线速率显著高于其他组(P<0.05)；保存4 d，0.4% SL组的精子直线速率显著低于其他4组(P<0.05)；保存5 d，0.4% SL组与对照组的精子直线速率显著低于其他3组(P<0.05)。保存1 d，0.3%、0.4% SL组的精子曲线速率显著低于其他组(P<0.05)，0.4% SL组最低；保存4 d，SL各组的精子曲线速率和路径速率显著高于对照组(P<0.05)；保存5、6 d，对照组的精子曲线速率和路径速率显著低于其他组(P<0.05)。

表3 不同浓度SL对低温保存湖羊精子运动性能的影响 μm/s

2.3 低温保存下不同浓度SL对湖羊精子质膜完整率的影响

由图1和表4可知，随着精液低温保存时间的延长，每组精子质膜完整率呈不断下降的趋势，其中采用0.1% SL保存的精子质膜完整率下降较为平缓。保存1、5 d，0.1% SL组的精子质膜完整率显著高于其他组(P<0.05)；保存2、3 d时，0.1%、0.2% SL组的精子质膜完整率显著高于其他各组(P<0.05)；保存4、6 d，0.3% SL组的精子质膜完整率显著低于其他组(P<0.05)。

A、B.尾部发生弯曲、肿胀，为质膜完整的精子；C.尾部呈直线状，为质膜不完整的精子。

表4 不同浓度SL对低温保存湖羊精子质膜完整率的影响 %

2.4 低温保存下不同浓度SL对湖羊精子顶体完整率的影响

由图2和表5可知，随着精液低温保存时间的延长，每组精子顶体完整率呈不断下降的趋势，其中采用0.1% SL保存的精子顶体完整率下降最为缓慢。保存1、2、5和6 d，SL各处理组的精子顶体完整率显著高于对照组(P<0.05)，0.1% SL组最高；保存2、6 d，0.1% SL组的精子顶体完整率显著高于其他组(P<0.05)；保存3 d，0.4% SL组与对照组的精子顶体完整率显著低于其他组(P<0.05)，对照组最低。

A.头部顶体区未着色，为顶体受损的精子；B.头部顶体区着色，为顶体完整的精子。

表5 不同浓度SL对低温保存湖羊精子顶体完整率的影响 %

3 讨论

卵黄是精子低温保存过程中最常用的一种冷冻保护剂。研究表明，精子稀释液中添加卵黄主要是利用其磷脂成分尤其是卵磷脂为精子在保存期间提供能量，降低精子细胞在降温过程中受到的损伤[7]。虽然卵黄有利于精液低温保存，但其含有动物源性成分，容易受到微生物污染(如沙门菌)，增加病原传播的风险[8]。除此之外，卵黄含有的颗粒成分也影响了精液品质。针对卵黄存在的多种缺点，需要开发一种既可以替代卵黄，又能在低温下保持理想精液质量的抗冻剂。SL是从大豆中提取的产物，是一种植物原料，成分确定、效果稳定且易于标准化生产操作[9]。此外，SL还具有与卵黄相似的组成成分(低密度脂蛋白)，可以保护精子免受低温打击。Sun等[10]应用含有2% SL稀释剂或含有20%卵黄稀释剂进行山羊精液冷冻保存，提高了超氧化物歧化酶(SOD)活性，抑制了活性氧(ROS)以及降低了丙二醛(MDA)含量，表明SL与卵黄能够起到相同的保护作用。Forouzanfar等[11]在冷冻保存绵羊精液试验中，发现向稀释液中添加SL比添加卵黄能够取得更高的精子活力、活率。因此，SL可作为卵黄的一种有效替代抗冻保护剂。

在本试验中，精液低温保存6 d效果最差，随着保存时间的延长湖羊精液检测的各项保存指标均呈下降趋势。这可能是因为精液保存时间越长，代谢产物就越多，稀释液就容易被污染，从而影响精液品质。精子活率、活力的高低直接影响了人工授精的成功率。SL可以作为抗氧化剂消除自由基造成的损害，从而提高低温保存后的活率和活力[12]。本试验结果显示，在低温保存精液6 d后，0.1% SL组的精子活率、活力分别从12.8%和8.33%显著提高到82.01%和72.7%，这可能由于SL含有的磷脂成分在细胞膜中起代谢与运输功能，支持细胞代谢，使卵磷脂在低温过程中进入精子细胞膜，补充受损的磷脂结构，降低细胞质溶液冰点，减少细胞中冰晶形成，降低冰晶对精子的损伤；而0.4% SL组的精子活率、活力却降低，这可能是由于加入的SL浓度达到一定程度时，精液稀释液的黏度增加，对精子运动产生较大阻力，消耗更多ATP能量，从而降低精液质量[13]。关于SL保护精子的机理尚不清楚，还需进一步深入研究。汪俊跃等[14]研究发现添加5% SL对猪精液保存效果最优。此前也有报道，山羊精液稀释液中添加SL的最适添加量为2%[10]。这些研究结果与本研究SL最适添加量均有所不同，这可能由于使用的SL纯度、研究物种或保存方式不同所致。物种特异性差异可能与精子质膜和精浆组成的差异有关[10]。此外，直线速率、曲线速率和路径速率与精子活率、活力呈正相关[15]。本研究中，在稀释液中添加0.1% SL可以延缓直线速率、曲线速率和路径速率的下降速度。据报道，在山羊精液稀释液中添加2% SL具有更高的运动性能(52.14%)，而添加3% SL显著降低了精子运动性能(38.61%)[10]；在犬精液稀释液中添加2% SL引起精子的运动性能降低[16]。上述研究均与本试验结果相似。因此，推测较低浓度SL可能提高精子运动性能，从而也显著提高精液保存效果，而较高浓度的SL具有毒性，对4 ℃保存的精液质量产生负面影响。

当温度降低产生冷应激时，会导致精子顶体和质膜破损以及出现解体的现象，而精子质膜以及顶体的完整性对精子的代谢、受精等活动都有十分重要的意义[17]。SL在低温保存过程中具有保护磷脂完整性的能力。本研究发现，0.1% SL组在保存1 d时精子质膜完整率和顶体完整率分别在82.81%和87.94%，优于6 d保存的质膜完整率(61.13%)和顶体完整率(69.04%)。宋望成[18]报道，1.0% SL保存24 h精子的质膜完整率和顶体完整率分别为46.8%和47.6%，而保存144 h又分别降低到23.4%和27.6%，这与本研究的精子质膜完整率和顶体完整率的下降速度一致。另外，本试验0.1% SL对精子质膜和顶体的保护效果最好。刘文江等[19]研究显示，山羊精液稀释液添加1 g/L SL，精子质膜完整性显著提高，精液的保存时间也显著延长，但精子顶体完整率未发生显著变化，这与本研究结果不一致，这可能是由于SL对精子顶体保护作用因研究对象而异。

4 结论

本研究发现，在湖羊精液稀释液中添加SL能够提高低温保存后的精子活率、活力、曲线速率、直线速率、路径速率、质膜完整率和顶体完整率，其中添加0.1% SL的作用效果最佳。