犊牦牛肾周棕色脂肪组织的发育及其产热相关基因的表达分析

陈付菊,赵宇田,马 敏

(1.青海大学农牧学院,青海 西宁 810016 ; 2. 甘泉县畜牧兽医服务中心,陕西 延安 716100)

动物体内存在2种形态和功能不同的脂肪组织,即棕色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT)和白色脂肪组织(White adipose tissue,WAT),两者在分布、形态、功能和基因表达上均存在差异。WAT主要分布于成年动物皮下、内脏、肌间和肌内等部位。BAT 首次发现于土拨鼠的肩胛部[1],随后在大鼠、小鼠和仓鼠等啮齿动物中均发现BAT的存在。在大鼠和小鼠中,50%～60%的BAT分布于肩胛部和颈背部,25%的BAT分布于肾周[2]。山羊和牛等反刍动物出生时,肾周、肩胛部、腹股沟和心包等部位的脂肪组织也为BAT,且大部分聚集于肾周区域[3-7]。近年来,应用正电子成像探查技术,发现成年人胸部、颈部、腋下、肩胛间、肩胛下、肾周、心脏和脊柱等区域均有BAT的存在[8]。形态上,BAT细胞内含有多个小脂滴和大量线粒体,WAT细胞内含有单个大脂滴和少量线粒体[9];功能上,BAT主要以产生热量的形式参与机体的体温调节,WAT主要以储存能量的形式参与机体的能量代谢[10]。

BAT作为真哺乳亚纲动物为适应寒冷而进化出的特有产热器官[8,11],其产热功能与标志分子解偶联蛋白1(Uncoupling protein 1,UCP1)密切相关[12],UCP1基因缺失小鼠因BAT 产热功能受损而在冷暴露中无法维持正常体温[13]。据此推测UCP1的含量和活性决定BAT的产热能力。此外,脂肪转化因子过氧化物酶体增殖激活受体α(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)和过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1 alpha,PGC-1α)作为促进棕色脂肪细胞形成的关键调控因子,能诱导原代棕色脂肪细胞的增生和BAT中UCP1的表达[14-17],从而增加动物的产热能力。

体温调节能力差是新生幼畜死亡的主要原因之一[18]。生活在海拔3 000～6 000 m的高原世居犊牦牛对高寒环境具有良好的适应性,但其寒冷适应机制目前尚不清楚。研究显示,新生幼畜的存活高度依赖于BAT的产热,通过维持核心体温以抵御外界寒冷环境[19],且肾周BAT在出生后承担主要的产热功能[20]。牦牛出生后其肾周BAT发育及其产热相关基因(UCP1、PPARα和PGC-1α)的表达如何变化目前尚不清楚,因此,本试验以犊牦牛肾周脂肪组织为研究对象,从脂肪细胞形态、脂滴和线粒体超微结构、脂肪细胞中UCP1 mRNA和蛋白表达以及产热相关基因(UCP1、PGC-1α和PPARα)mRNA表达等方面,分析犊牦牛肾周BAT发育及其产热相关基因的变化规律,以期为进一步探究犊牦牛寒冷适应机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理 青海省大通县养殖推广中心牦牛培育方式多采用自然放牧,即牦牛出生后由母牦牛哺乳,并自由采食。在2021年4月份,选取1日龄、7日龄和30日龄的雄性健康犊牦牛各3头,不同日龄犊牦牛的平均体重分别为13.31、17.45和28.32 kg。

犊牦牛经颈静脉放血处死后,迅速采集肾周脂肪组织。采集的组织分为三部分,其中一部分用4%多聚甲醛缓冲液(pH 7.4)固定,用于苏木精-伊红染色(Hematoxylin and eosin staining,H.E. staining)和免疫组织化学染色;一部分用2.5%戊二醛在4 ℃条件下固定,用于线粒体和脂滴超微结构观察;一部分组织于液氮中保存,用于实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测。

1.2 主要试剂 4%多聚甲醛缓冲液、2.5%戊二醛、无水乙醇、二甲苯、双氧水(H2O2)、中性树胶、苏木精-伊红染色试剂盒、四氧化锇、醋酸铀和柠檬酸铅等,均购自北京宝日医生物技术有限公司;RNA Easy Fast 动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(货号:DP451)、FastKing cDNA 第一链合成试剂盒(货号:KR118)和SuperReal 彩色荧光定量预混试剂 (SYBR Green)(货号:FP215),均购自北京天根生化科技有限公司;兔抗UCP1多克隆抗体(货号:ab10983),购自英国Abcam公司;蛋白裂解液(货号:G2002-100ML)和增强型化学发光试剂(Enhanced chemiluminescence,ECL)显色液(货号:102031748),均购自Bio-Rad公司;兔抗β-actin多克隆抗体(货号:GB15003-100)、蛋白质上样缓冲液(货号:G2002-30ML)、蛋白Marker(货号:G2086-250UL)和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(货号:G6044-0.45),均购自武汉赛维尔生物科技有限公司;山羊抗兔IgG(货号:B900210)和增强型二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒(货号:PK10005),均购自武汉三鹰生物技术有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗IgG(货号:SE134),购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器 光学显微镜(BX53),日本Olympus公司产品;透射电子显微镜(JEOLJEM-1400),日立科学仪器(北京)有限公司产品;荧光定量PCR仪(CFX Opus 96),上海艾研生物科技有限公司仪器部产品;化学发光凝胶成像系统(OmegaLum G),环亚生物科技有限公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 石蜡切片与H.E.染色 取4%多聚甲醛缓冲液(pH 7.4)固定的肾周脂肪组织制作组织蜡块,6 μm厚切片后,脱蜡、H.E.染色、脱水、透明、封片。每个日龄每头犊牦牛随机选取5张切片,每张切片在200倍视野下随机选取6个不同区域,于光学显微镜下观察脂肪细胞形态并拍照,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件统计每个区域中脂肪细胞的面积和密度。

1.4.2 透射电子显微镜观察 将2.5%戊二醛固定的肾周脂肪组织用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)洗涤3次,每次5 min。1%四氧化锇固定1 h,梯度酒精脱水,环氧树脂包埋,定位,制成超薄切片(60～80 nm),经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后,于透射电子显微镜下观察脂滴和线粒体的超微结构并拍照。

1.4.3 免疫组织化学染色 石蜡切片按照1.4.1中的方法脱蜡后,经梯度乙醇脱水,置于含0.01 mol/L柠檬酸钠抗原修复缓冲液(pH 6.0)的修复盒中,于微波炉内进行抗原修复15 min(高火8 min,低火7 min)。用3% H2O2于37 ℃下作用10 min使内源性过氧化物酶灭活,加入兔抗UCP1多克隆抗体(1∶500倍稀释),4 ℃过夜孵育,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗IgG,37 ℃孵育30 min,PBS洗涤3次,每次5 min,增强型DAB显色试剂盒显色,苏木精复染,自来水返蓝,脱水,透明,封片。按照1.4.1中操作选取切片的不同区域,于光学显微镜下观察UCP1在脂肪细胞的阳性表达并拍照,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件统计UCP1的阳性表达强度。

1.4.4 实时荧光定量PCR检测 根据GenBank已公布的UCP1、PGC-1α和PPARα基因的编码序列(Coding sequence,CDS),运用Prime 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物,选取GAPDH作为内参基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息见表1。

利用RNA Easy Fast 动物组织/细胞总RNA提取试剂盒提取不同日龄犊牦牛肾周脂肪组织中总RNA,然后取2 μg总RNA通过FastKing cDNA 第一链合成试剂盒进行反转录以获得相应的cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。反应体系(20 μL):SYBR 预混液10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2.0 μL,加水至20 μL;反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共45个循环。每个样品做3次重复,以GAPDH为内参基因,采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.4.5 Western blot检测 称取不同日龄犊牦牛肾周脂肪组织样品各0.5 g,研磨至细粉状,加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(1∶10),冰浴30 min,12 000 g离心5 min取上清液,按4∶1比例与5×蛋白上样缓冲液混合,在95 ℃恒温金属浴中加热10 min 使蛋白变性。蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,用湿转法转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,加兔抗UCP1多克隆抗体(1∶2 000)、兔抗β-actin多克隆抗体(1∶50 000),4 ℃孵育过夜,用含有吐温20的磷酸盐缓冲液(1×)洗1 h,加入山羊抗兔IgG(1∶5 000),室温孵育2 h,用含有吐温20的磷酸盐缓冲液(1×)洗3次,每次10 min。滴加ECL显色液显影,用天能GIS机箱控制软件V2.0对条带进行灰度值分析,目的蛋白与β-actin蛋白条带灰度值做比较,计算目的条带的相对表达量。

1.5 统计分析 结果均采用“平均值±标准误(Mean±SEM)”表示,采用SPSS 17.0软件对试验数据进行单因素方差分析,不同日龄犊牦牛肾周脂肪组织的UCP1、PPARα和PGC-1α基因mRNA表达水平、脂肪细胞面积和密度以及UCP1蛋白表达水平进行独立性t检验,以P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 犊牦牛肾周脂肪细胞显微结构的观察 如图1所示,1日龄犊牦牛肾周脂肪细胞多为小脂滴的棕色脂肪细胞(图1A),7日龄犊牦牛部分小脂滴的棕色脂肪细胞转变为单个大脂滴的白色脂肪细胞(图1B),30日龄犊牦牛多数棕色脂肪细胞转变为白色脂肪细胞,但仍有一定数量的棕色脂肪细胞分布,且这些棕色脂肪细胞多分布于白色脂肪细胞之间(图1C)。

图1 不同日龄犊牦牛肾周脂肪细胞的显微结构观察 (H.E.染色)Fig.1 Microstructure observation in kidney-adjacent adipocytes of yak calves at different ages (H.E. staining)A:1日龄; B:7日龄; C:30日龄; 白色箭头:棕色脂肪细胞; 黑色箭头:白色脂肪细胞A:1-day-old; B:7-day-old; C:30-day-old; White arrow:Brown adipocyte; Black arrow:White adipocyte

对不同日龄犊牦牛肾周脂肪细胞的面积和密度的统计结果显示,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周白色脂肪细胞的面积和密度均显著增加(P<0.05),7日龄与30日龄的白色脂肪细胞的面积差异不显著(P>0.05)(图2A、2B);与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周棕色脂肪细胞的面积和密度均显著降低(P<0.05),7日龄和30日龄的棕色脂肪细胞的面积差异不显著(P>0.05)(图2C、2D)。

图2 不同日龄犊牦牛肾周脂肪细胞的面积和密度Fig.2 Area and density in kidney-adjacent adipocytes of yak calves at different agesA:白色脂肪细胞面积; B:白色脂肪细胞密度; C:棕色脂肪细胞面积; D:棕色脂肪细胞密度字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同或无标记表示差异不显著(P>0.05); 下同A:White adipocyte area; B:White adipocyte density; C:Brown adipocyte area; D:Brown adipocyte densityDifferent letters indicate significant differences (P<0.05),same letter or no letter indicate no significant differences (P>0.05). The same as below

2.2 犊牦牛肾周脂肪细胞脂滴和线粒体超微结构的观察 如图3所示,1日龄犊牦牛肾周脂肪细胞内脂滴多为小脂滴(图3A),脂滴间可见大量有嵴的圆形、椭圆形或杆状的线粒体(图3A、3B)。7日龄犊牦牛肾周脂肪细胞内既有小脂滴,也有大脂滴(图3C),在脂滴间也分布有一些有嵴的线粒体(图3C、3D)。30日龄犊牦牛肾周脂肪细胞内脂滴多为单个空泡状的大脂滴,大多数脂滴几乎占满了整个细胞,在大脂滴之间可见少量的小脂滴(图3E),小脂滴周围分布有少量有嵴的线粒体(图3E、3F)。

图3 不同日龄犊牦牛肾周脂肪细胞脂滴和线粒体超微结构观察(透射电子显微镜)Fig.3 Ultrastructure observation of lipid droplets and mitochondria in kidney-adjacent adipocyte of yak calves at different ages (Transmission electron microscopy)A、B:1日龄; C、D:7 日龄; E、F:30 日龄; LD:脂滴; mt:线粒体; N:细胞核A,B:1-day-old; C,D:7-day-old; E,F:30-day-old; LD:Lipid droplet; mt:Mitochondria; N:Nucleus

2.3 犊牦牛肾周脂肪细胞UCP1阳性表达的观察 如图4所示,不同日龄犊牦牛肾周棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞质膜上均有UCP1的阳性表达。对不同日龄犊牦牛肾周脂肪细胞的UCP1阳性表达强度的统计结果显示,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪细胞的UCP1阳性表达强度均显著降低(P<0.05);与7日龄相比,30日龄犊牦牛肾周脂肪细胞的UCP1阳性表达强度显著降低(P<0.05)。

图4 不同日龄犊牦牛肾周脂肪细胞中UCP1阳性细胞(免疫组织化学染色)Fig.4 UCP1-positive adipocytes in kidney-adjacent adipocytes of yak calves at different ages (Immunohistochemical staining)A:1日龄; B:7 日龄; C:30 日龄; 箭头:UCP1阳性脂肪细胞A:1-day-old; B:7-day-old; C:30-day-old; Arrow:UCP1-positive adipocytes

2.4 犊牦牛肾周脂肪组织UCP1、PPARα和PGC-1α基因mRNA表达水平 如图5所示,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1(图5A)和PPARα(图5B)基因mRNA表达水平均显著下降(P<0.05),7日龄与30日龄的UCP1和PPARα基因mRNA表达水平差异不显著(P>0.05);30日龄犊牦牛肾周脂肪组织中PGC-1α(图5C)基因mRNA表达水平较1日龄与7日龄均显著下降(P<0.05),1日龄与7日龄的PGC-1α基因mRNA表达水平差异不显著(P>0.05)。

图5 不同日龄犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1(A)、PPARα(B)和PGC-1α(C)基因mRNA表达水平Fig.5 UCP1 (A),PPARα (B),and PGC-1α (C) gene mRNA expression levels in kidney-adjacent adipocytes of yak calves at different ages

2.5 犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1蛋白表达水平 如图6所示,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);7 日龄与30日龄的UCP1蛋白表达水平差异不显著(P>0.05)。

图6 不同日龄犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1蛋白表达水平Fig.6 Protein expression levels in kidney-adjacent adipocytes of yak calves at different ages

3 讨论

3.1 犊牦牛肾周脂肪细胞的鉴定 如前所述,哺乳动物体内存在2种类型的脂肪细胞,即白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞,两者在形态和基因表达上均存在差异。其中,白色脂肪细胞含有单个大脂滴与少量线粒体,几乎不表达或低表达UCP1,不具有产热功能;棕色脂肪细胞含有多个小脂滴与大量线粒体,高表达UCP1,具有产热功能[21-22]。本试验通过H.E.染色观察发现,犊牦牛肾周存在2种类型的脂肪细胞,即棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞。通过透射电镜观察2种类型脂肪细胞的脂滴和线粒体超微结构发现,棕色脂肪细胞内含有多个小脂滴,且有较多的线粒体,而白色脂肪细胞内脂滴多为单个大脂滴,大部分脂滴几乎占满整个细胞,且线粒体数量较棕色脂肪细胞少,这一研究结果与Kleini等[23]和方勤圆等[24]的研究结果一致。通过免疫组织化学染色观察脂肪细胞UCP1阳性表达发现,小脂滴的棕色脂肪细胞和大脂滴的白色脂肪细胞的质膜上均有UCP1阳性表达,且棕色脂肪细胞质膜上UCP1阳性表达强于白色脂肪细胞。Western blot检测结果进一步表明棕色脂肪组织中UCP1蛋白表达量高于白色脂肪组织。以上结果提示,犊牦牛肾周存在2种类型的脂肪细胞,即典型的棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞,且棕色脂肪细胞高表达UCP1,白色脂肪细胞低表达UCP1,此结果与Casteilla等[4]和方勤圆等[24]的研究结果一致。

3.2 犊牦牛肾周BAT的发育 大量研究表明,在反刍动物出生后,其肾周BAT逐渐转变为WAT。Kleini等[23]的研究结果显示,牛肾周BAT在妊娠194～240 d迅速发展,在出生后2～30 d转变为WAT。绵羊和山羊的BAT含量在出生第1天时达到最高,出生后1～28 d棕色脂肪细胞逐渐转变为白色脂肪细胞,但也不会完全消失[25-29]。本试验对1日龄、7日龄和30日龄犊牦牛肾周BAT发育的研究结果显示,1日龄犊牦牛肾周大部分脂肪细胞为含有小脂滴和较多线粒体的棕色脂肪细胞,7日龄犊牦牛部分棕色脂肪细胞转变为含单个大脂滴和较少线粒体的白色脂肪细胞,30日龄犊牦牛大部分棕色脂肪细胞转变为白色脂肪细胞,但白色脂肪细胞间仍存在一定数量的棕色脂肪细胞。免疫组织化学染色结果显示,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周脂肪细胞质膜上的UCP1阳性表达强度显著降低,这可能与7日龄和30日龄时犊牦牛肾周棕色脂肪细胞减少而白色脂肪细胞增加有关,表明在7日龄和30日龄时犊牦牛肾周棕色脂肪细胞转变为白色脂肪细胞,此结果与以往的研究结果[4,6-7,23]一致。

3.3 犊牦牛肾周脂肪组织中UCP1、PGC-1α和PPARα基因mRNA表达及产热 哺乳动物通过震颤性产热(Shivering thermogenesis)和非震颤性产热(Non-shivering thermogenesis,NST)2种产热机制来应对寒冷环境[8],其中NST是小型哺乳动物,尤其是新生动物低温生存的重要策略,而BAT作为NST的主要产热器官(约占NST的70%),在机体的体温调节中发挥重要的作用,其含量和功能动态可以反映NST能力的变化趋势[30]。研究表明,羔羊刚出生时,其体内BAT含量达到最高,NST占总产热作用的70%左右,随着出生后肌肉组织通过震颤拥有产热能力,BAT含量急剧减少,NST显著降低,但也不会全部消失[31-32]。UCP1被认为是调控BAT产热的关键基因[33],其含量和活性决定脂肪组织的产热能力。PPARα和PGC-1α能诱导原代棕色脂肪细胞的增生和BAT中UCP1的表达[14-17],从而增加动物的产热能力。研究显示,羔羊产后12 h内BAT产热能力达到峰值,且BAT产热基因,如UCP1、PGC-1α和PPARα的表达也达到峰值,出生后7～14日龄,UCP1 mRNA表达量显著下降[34]。本试验结果显示,与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周棕色脂肪细胞逐渐转变为白色脂肪细胞,且BAT产热相关基因(UCP1、PGC-1α和PPARα)表达显著降低,与Kleini等[23]对牛科动物的研究结果一致,提示与1日龄犊牦牛相比,7日龄和30日龄犊牦牛肾周BAT的NST逐渐降低,可能与牦牛出生后通过肌肉组织震颤获得震颤性产热有关。

综上所述,本试验从脂肪细胞形态、脂滴和线粒体超微结构、UCP1蛋白分布和表达以及产热相关基因(UCP1、PGC-1α和PPARα)mRNA表达水平方面,系统探究犊牦牛肾周BAT发育及其产热,证明了出生后犊牦牛肾周棕色脂肪细胞数量减少而白色脂肪细胞数量增加,且BAT产热相关基因表达水平降低,为犊牦牛寒冷适应机制研究提供理论依据。