陕西西安阎良区及毗邻区域奶山羊传染性胸膜肺炎横断面调查和风险因素分析

董 钊,李忠军,张 涛,王玉梅,陈 峰,杨厚安,朱 琳,张 飞,尤鹏飞,崔忠华,张 璞,何勇君0

(1. 西安市动物疫病防疫控制中心,陕西 西安 710061 ; 2. 西安市阎良区动物疾病预防控制中心,陕西 西安 710089 ; 3. 宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心,宁夏 银川 750004 ; 4. 山东省动物疫病预防与控制中心,山东 济南 250100 ; 5. 西安市临潼区动物疾病预防控制中心,陕西 西安 710600 ; 6. 中国动物卫生与流行病学中心,山东 青岛 266032 ; 7. 西安市阎良区武屯镇畜牧兽医站,陕西 西安 710089 ; 8. 西安市阎良区关山镇畜牧兽医站,陕西 西安 710089 ; 9. 西安市高陵动物疫病防疫控制中心,陕西 西安 710200 ; 10.汉中市城固县老庄镇农业综合服务站,陕西 汉中 723000)

奶山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)主要是由山羊支原体山羊肺炎亚种引起的一种高度接触性的呼吸道传染病[1];山羊支原体丝状亚种和绵羊肺炎支原体也可导致感染该病[2]。该病可经呼吸道传播,具有潜伏期长、感染率高、治疗困难和死亡率高的特点。该病可分为最急性型、急性型和慢性型,其中前2种较为常见且最易感染,威胁最大;慢性型病症较轻,致死率较低,却最易复发和诱发其他病症,难以彻底治愈[3],致使饲养成本增大,羊只利用年限降低。

陕西省作为全国最大的奶山羊生产基地,打造了千亿级奶山羊全产业链。西安市奶山羊板块主要布局在市辖区以东的阎良区、临潼区和高陵区等地。陕西省重点建设的奶山羊特色小镇坐落于阎良区,占全国产能的40%。近年的流行病学调查结果显示,阎良区及毗邻区部分奶山羊养殖场点曾出现CCPP。为了更好地促进区域内奶山羊产业健康发展,掌握该病感染抗体情况,分析疫病传播的风险因素,本团队于2021年7—8月在阎良区及毗邻区域开展了调查分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象 确定研究区域、目标群和研究单元。研究区域为阎良区全区7个镇(街道)以及毗邻的临潼区4个镇(街道)和高陵区的2个镇(街道),共计403个场点。目标群为区域内羊存栏量≥30只的场点245个和散养村158个(村内所有存栏量<30只的养殖户视为1个群),共计403个场点(羊存栏量共58 468只)。研究单元分为场群层面和个体层面,场群层面为每个规模场或村,个体层面为1个场点内3～24月龄未免疫CCPP疫苗的山羊。

1.2 抽样策略和样本量 采取二阶段抽样,以区域内403个场点作为抽样框,对场点进行编号。第1阶段以估计流行率的计算公式(1)[4]估计场点数。

(1)

式中P代表预期流行率(Expected prevalence),设为50%;e代表可接受绝对误差(Acceptable absolute error),设为10%;Z代表标准正态分布中概率为0.05所对应值,设为1.96。对抽样框内场点进行简单随机抽样,再根据3个区的场点数按比例分配抽样数,在层内进行简单随机抽样。第2阶段以发现疫病的计算公式(2)和(3)[4]估计场内个体样本量,在场内进行简单随机抽样。

(2)

D=N×P

(3)

式中Se代表检测试验敏感性(Sensitivity),设为93%[5];CI代表置信区间(Confidence interval),设为95%;D代表群内阳性动物数;P代表预期流行率(Expected prevalence),设为20%(根据预调查确定);N代表群内个体数。

1.3 问卷调查和采样检测 经查阅资料设计结构化、封闭式问卷,并进行预调查,罗列出问场点概况、引种情况和病畜处置等因素作为风险因素分析的潜在因素。采集山羊血液并分离血清,按照山羊支原体山羊肺炎亚种抗体ELISA试剂盒(广州悦洋生物技术有限公司)说明书进行检测。

1.4 病例定义 阳性个体为经山羊支原体山羊肺炎亚种抗体ELISA试剂盒检测为血清学阳性样本所对应的个体。阳性场群为群体内至少有4只山羊确诊为阳性个体所在的群体(根据Cut-off值确定)。

1.5 数据计算和统计

1.5.1 群敏感性(Herd sensitivity,HSe)和群特异性(Herd specificity,HSp) 根据公式(4)和(5)计算最适合检测阳性数(Cut-off值)所对应的HSe和HSp,并根据公式(6)计算约登指数[4]。

HSe=1-[1-PSe-(1-P)(1-P)]n

(4)

HSp=Spn

(5)

Youden Index=HSe+HSp-1

(6)

式中Se代表检测试验敏感性,设为93%;Sp代表检测试验特异性,设为88%;P代表流行率,设为20%;n代表平均个体抽样数,为个体抽样总数与场群抽样总数相除所得值;Youden Index代表约登指数。

1.5.2 表观流行率和真实流行率计算 将抽样数、阳性数、Se、Sp等指标带入公式(7)～(11)[4],计算群表观流行率、个体表观流行率、群真实流行率、个体真实流行率和95%CI。

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

式中HAP代表群表观流行率(Herd apparent prevalence);AP代表个体表观流行率(Apparent prevalence);HTP代表群真实流行率(Herd true prevalence);TP代表个体真实流行率(True prevalence);Se代表检测试验敏感性,设为93%;Sp代表检测试验特异性,设为88%;95%CI代表95%置信区间;n代表抽样数;P代表流行率;Z代表标准正态分布中概率为0.05所对应值,设为1.96。

1.5.3 数据统计分析 将问卷信息Excel 录入,采用IBM SPSS Statistics 25软件进行统计分析。将阳性群和阴性群与各因素之间进行卡方检验计算关联,筛选潜在风险因素。将单因素分析筛选出的因素作为自变量,实验室检测所判定的阳性群和阴性群作为因变量,按照二元Logistic回归的方法进行多因素分析,得到回归模型,绘制ROC曲线(Receiver operating characteristic curve),评估模型的拟合度。

2 结果

2.1 样品采集 实际抽取场点共计79个(图1,其中阎良区38个、高陵区14个、临潼区27个),个体样本共计1 233份。

图1 采样场点分布Fig.1 Distribution of sampling regions圆点:场点分布(蓝色:阎良区; 粉色:临潼区;黄色:高陵区); 五角星:检测阳性场点分布Dots: Distribution of sampling sites (Blue: Yanliang District; Pink: Lintong District; Yellow: Gaoling District); Five-pointed stars: Distribution of positive test sites

2.2 HSe和HSp计算 经计算,当Cut-off值为1和2时,HSe达到95%以上,但对应的HSp太低,会导致检测阴性的样本中出现假阴性的概率较高;当Cut-off值为3和4时,计算约登指数分别为57.10%和58.60%。因此,选择约登指数最大值对应的Cut-off值,即当Cut-off值为4时,HSe为70.2%、HSp为88.4%,可以较好确保感染群被检出的可能性又兼顾特异性,结果见表1。

表1 不同Cut-off值对应的群敏感性和群特异性Table 1 Herd sensitivity and herd specificity corresponding to different Cut-off value (%)

2.3 血清学流行率 群体层面共抽取了79个场点,检出阳性场点20个,HAP为25.32%,HTP为23.41%(14.07%～32.74%),其中阎良区、高陵区和临潼区HTP分别为16.13%(4.44%～27.83%)、28.96%(5.20%～52.72%)和30.77%(13.36%～48.18%)(表2)。个体层面共抽取了1 233份样本,检出阳性样本129份,AP为10.46%(8.81%～12.31%),由于检测方法固有的Sp相对较低(88.00%),无法直接计算TP。

表2 血清学检测结果Table 2 Serological test results

2.4 风险因素

2.4.1 单因素分析 对79个场点进行流行病学问卷调查,问卷回收率100%。将问卷中的风险因素转换为二分类变量,经关联强度测量和相关性检验筛选出3个具有统计学意义的因素(P<0.05),分别为“是否中大规模场点”“场内是否建立免疫程序”“病羊是否采取隔离、治疗”(表3)。

表3 羊传染性胸膜肺炎传播风险单因素分析Table 3 Univariate analysis of the transmission risk of contagious pleuropneumonia in sheep

2.4.2 多因素分析 考虑到所调查的风险因素个数较多,筛选条件予以放宽,在此将单因素回归0.05≤P<0.2的3个因素(“车辆及物料入场是否消毒”“是否定期驱虫”“经济人是否允许进入生产区”)和单因素分析所筛选的P<0.05的3个风险因素(“是否中大规模场点”“病羊是否采取隔离、治疗”“场内是否建立免疫程序”)进行多因素Logistic回归;Hosmer-Lemeshow检验显示,回归模型拟合度较好(P>0.05)。回归结果显示,“是否中大规模场点”和“病羊是否采取隔离、治疗”在阳性场与阴性场之间差异显著(P<0.05),是CCPP传播的主要风险因素,回归方程为Logit(P)=-2.580+1.466X1+2.357X2(表4)。绘制ROC曲线,曲线下面积为0.822(95%CI:0.694～0.950)(图2),表明回归模型预测性能符合预期。

表4 Logistic回归结果Table 4 Logistic regression results

图2 Logistic 回归模型预测概率的ROC曲线Fig.2 ROC curve of Logistic regression model predicting probabilities

3 讨论

CCPP是一种高度传染性呼吸道疾病,该病出现在全球40多个国家,尤其是非洲、亚洲和中东。本调查通过概率抽样方法掌握了CCPP的HSP并研究传播风险因素。病例定义中,将阳性群定义为群内至少有4只山羊确诊为阳性个体,降低了假阳性出现的概率。通过横断面调查发现,西安市阎良区及毗邻区域该病的HTP为23.41%(14.07%～32.74%)、AP为10.46%(8.81%～12.31%),对所检出的129个阳性样本进行背景调查,绝大多数山羊未出现典型的症状,说明CCPP在该区域存在一定的流行,但处于温和感染状态或非急性型感染。阎良区的HTP和AP在3个区中较低,这是由于该区近3年来对辖区内所有羊只逐年开展一遍布鲁氏菌病血清学检测[6],在调查和采样期间也对CCPP等羊只主要传染病予以发现和防控。由于CCPP为非强制免疫病种,该疫苗在区域内的实际接种率较低且主要用于紧急免疫。李胜等[7]对新疆伊犁地区规模羊场绵羊CCPP的免疫效果进行研究,免疫1次山羊支原体肺炎灭活疫苗的山羊感染CCPP情况较免疫前降低了8.3%。因此,建议本调查区域内风险较高的场点可采用山羊支原体肺炎灭活疫苗预防。单因素风险分析结果显示,“中大规模场点”“场内未建立免疫程序”“病羊未采取隔离、治疗”共3个因素存在显著差异,初步提示与CCPP传播具有关联;进一步将单因素分析0.05≤P<0.2的变量纳入多因素分析,是考虑到一些变量虽然经单因素分析P≥0.05,但该变量在多因素回归中有可能P<0.05,以尽量不漏掉可能的因素。回归结果显示,“中大规模场点”“病羊未采取隔离、治疗”是CCPP传播的主要风险因素。“中大规模场点”风险与“散养村场点”风险的比值比为4.33(1.16～16.24),这是由于受感染羊只和羔羊之间的密切接触对于有效传播至关重要;群规模越大,病健羊只间接触的频次越高[8]。当地饲养模式多为放牧/混养模式,未能做到合理分栏管理;相比小群,大群中各种病原体持续存在并可导致混合感染[9];另外,小群易于管理,有利于快速消除病原体感染。虽然“中大规模场点”作为筛选出的风险因素,但目前调查区域内在鼓励发展奶山羊产业,饲养规模趋向于集约化,在规模上升的同时要加强生物安全管理水平,减少羊只接触,特别是减少12月龄以上羊只和幼羊的接触,降低幼羊潜在风险因素。另外,“病羊未采取隔离、治疗”场点风险与“病羊采取隔离、治疗”场点 风险的比值比为10.56(2.60～42.97),这与Kipronoh等[9]和Elemo等[10]的研究结果相符,他们注意到CCPP血清学阳性与无法获得治疗之间存在显著的关联;这可能由于缺乏治疗可导致更多的疾病传播,病原体会在没有治疗或没用抗生素的情况下持续较长时间,导致疾病反复发生。Lignereux等[11]进行的沙瞪羚群CCPP传播动力学研究发现,疫病远距离传播尽管实施了生物安全措施,但CCPP可以从一组围栏传播到另一组相距达80 m的围栏。本调查区域CCPP处于温和发展,临床难以观察且出现临床症状的动物得不到有效隔离,导致疫病传播。养殖场应及时隔离治疗或者淘汰患病羊,有条件的场点可开展CCPP检测净化。

羊CCPP的流行病学研究较少,在国际上以暴发调查和病原分离研究为主,而关于血清流行率和相关风险因素的报道很少;CCPP在国内确认暴发的报道很少,该病的真实流行情况在很大程度上仍然未知。本调查在国内开展了CCPP横断面研究,对掌握区域内该病的分布和传播风险因素具有重要意义。但本调查还存在一定的局限性,例如所采用ELISA检测方法的Se和Sp相对不高;所得AP为10.46%,与1.2中设定的预期流行率(20%)有所差距,这可能是由于预期流行率设置的较高导致样本量较少,从而引起阳性数有所偏差。本调查中未考虑年龄因素,经查阅相关文献,12月龄以上的羊只CCPP感染率(48.83%)大于6月龄以下的羊只(16.27%)[12];把现饲养规模是否≥30只作为饲养规模变量的界限会导致一定的选择偏倚;此外,本调查未考虑气候因素,Fasil等[13]研究结果显示,血清阳性与季节之间存在的显著关联,表明动物的易感性在冬季增加,冬季血清阳性病例(81.39%)多于夏季(18.6%),尤其是从10月末到次年3月。此外,本调查的问卷设计还需要完善,调查员可能会误报或瞒报,导致回忆偏倚和选择偏倚。