基于网络药理学探讨藤梨根治疗结直肠癌的作用机制※

吴 赛 王馨璐 陆玮兰 汪海慧 李海涛 闫国良△

(1.上海中医药大学2019级硕士研究生,上海 201203;2.上海中医药大学附属市中医医院急诊科,上海 200071;3.上海中医药大学2020级硕士研究生,上海 201203)

结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,其中41%的结直肠癌发生在近端结肠,22%发生在远端结肠,28%发生在直肠[1]。据统计显示,全世界每年有近90万人因结直肠癌死亡,人口老龄化、吸烟、肥胖、久坐不动及不健康饮食习惯等因素均可增加罹患结直肠癌的风险[2-3]。近年来,我国结直肠癌的发病率和死亡率逐年攀升,并有年轻化的趋势[4]。随着现代医疗技术的发展,对结直肠癌的认识也逐渐深入,除了传统的手术、放疗、化疗等治疗方法外,靶向治疗、免疫治疗、中医药治疗等治疗手段也日益成熟,其中中医药作为重要的辅助治疗手段,在恶性肿瘤的治疗中发挥着越来越重要的作用[5]。藤梨根又名猕猴桃根,具有清热解毒、健胃利湿消肿的功效,临床上多用于肿瘤的辅助治疗,如食管癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等,具有明显的抗癌作用[6]。为了进一步研究藤梨根的抗癌作用,本文以网络药理学研究方法探讨藤梨根治疗结直肠癌相关靶点及作用机制,以期促进中医药在结直肠癌治疗中的应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 药物活性成分的筛选及靶点的获取 首先从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)中以“藤梨根”“猕猴桃根”为关键字获取药物活性成分,通过生物利用度(OB)和类药性(DL)两个指标,以OB>30%和DL>0.18为限定条件,筛选出主要活性成分,再通过中医药整合药理学研究平台(TCMIP)(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)筛选出药物活性成分对应的作用靶点。

1.1.2 疾病靶点的筛选 通过GeneCard数据库(http：//www.genecards.org/)和OMIM 数据库(https：//omim.org/)以“colorectal cancer”为关键字搜索与结直肠癌相关的靶点。

1.2 研究方法

1.2.1 交集靶点的获取 将获取的藤梨根药物活性成分靶点与结直肠癌疾病靶点用R语言及VennDiagram作图数据包映射筛选得出药物与疾病的交集靶点,绘制韦恩图,即可得到藤梨根治疗结直肠癌的潜在治疗靶点。

1.2.2 “药物-成分-靶点-疾病”网络图的构建 将藤梨根治疗结直肠癌的潜在治疗靶点与对应活性成分匹配后,通过Cytoscape 3.7.1建立“药物-成分-靶点-疾病”网络图,线与线连接的每个节点代表的是基因、分子或者蛋白质,节点与节点之间的连线代表着这些有效成分及分子、基因与疾病之间的相互作用关系,并得到其Degree值,根据药物活性成分与疾病靶点连接情况,预测藤梨根与结直肠癌之间相互作用关系,筛选关键核心成分。

1.2.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 将藤梨根治疗结直肠癌的潜在治疗靶点导入String数据库中,构建藤梨根治疗结直肠癌的PPI网络。限定物种设置成为“人类”,最低相互作用阈值为“中等置信度0.4”,获取蛋白的相互作用关系,结果保存为TSV格式,再使用Cytoscape 3.7.1软件进行网络拓扑分析,选择关键靶点。

1.2.4 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 在David 6.8数据库中导入藤梨根药物活性成分与结直肠癌疾病的交集靶点,输入靶基因名称列表,选择物种为“人类”,在此数据库中将靶点基因修正为官方名称(“official gene symbol”),设定阈值P<0.05,获得交集靶点的GO功能富集分析中生物过程(BP)数据和KEGG通路分析数据,并利用R语言3.6.3绘制GO功能富集分析的BP气泡图和KEGG通路富集分析的柱状图。

2 结果

2.1 药物活性成分及靶点的筛选 通过TCMSP数据库,以OB>30%、DL>0.18为筛选条件,共得到藤梨根药物主要活性成分6个,再通过TCMIP平台对药物活性成分的作用靶点进行预测并去重,得到药物作用靶点154个。见表1。

表1 藤梨根药物主要活性成分

2.2 疾病靶点筛选及潜在治疗靶点的获取 从 GeneCards和OMIM数据库中去重后检索到结直肠癌相关靶点10 622个。将藤梨根药物活性成分靶点与结直肠癌疾病靶点取交集得到藤梨根治疗结直肠癌的潜在治疗靶点145个。

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络图的构建及分析 利用Cytoscape 3.7.1 软件将上述得到的藤梨根治疗结直肠癌的145个潜在治疗靶点构建成“药物-成分-靶点-疾病”的可视化网络图。藤梨根的6个主要活性成分芦荟大黄素(aloe-emodin)、ent-表儿茶素(ent-Epicatechin)、(+)-儿茶素[(+)-catechin]、槲皮素 (quercetin)、谷甾醇 (sitosterol)及β-谷甾醇 (beta-sitosterol)均为治疗结直肠癌的关键核心成分。见图1。

图1 “药物-成分-靶点-疾病”的可视化网络图

2.4 PPI网络的构建及关键靶点筛选 将藤梨根治疗结直肠癌的145个潜在治疗靶点导入String 数据库中进行PPI网络构建,显示靶点之间的互作关系,再通过Cytoscape 3.7.1软件进行网络拓扑分析,得到的关键靶点有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、JUN、胱天蛋白酶3(CASP3)、IL-1B、表皮生长因子受体(EGFR)、ESR1等。见图2。

图2 藤梨根治疗结直肠癌潜在治疗靶点的PPI图

2.5 GO功能富集分析及KEGG 通路富集分析 将藤梨根治疗结直肠癌的145个潜在治疗靶点进行GO功能富集分析及KEGG 通路富集分析。因为考虑到BP是药物发挥治疗功效的主要因素,故本研究只观察了BP数据。GO功能富集分析结果显示,共得到BP条目141个,主要涉及DNA 结合转录因子活性、转录因子活性、细胞因子活性、血红素结合抗氧化活性、核激素受体结合、过氧化物酶活性、转录共调节因子结合泛素样蛋白连接酶等生物过程。KEGG通路富集分析结果显示,主要涉及晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、IL-17信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路等。见图3、4。

图3 GO功能富集分析BP气泡图

图4 KEGG通路富集分析柱状图

3 讨论

结直肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤,同时也是全球癌症死亡的主要原因之一,由于其早期缺乏明显的症状,一旦出现便血、腹痛等症状,病程已经达到中晚期[7]。西医对于结直肠癌的治疗手段主要是采用手术清除病灶组织,以及联合放化疗等,虽能延长患者生存期,但是术后较容易复发。中医药在治疗结直肠癌方面具有经济、多靶点、高效、毒副作用低等优点,近年来已成为结直肠癌患者主要的辅助治疗方案之一。藤梨根是中医临床治疗结直肠癌时较为常用的一味中药,具有清热利湿、健脾和胃、解毒祛邪的功效,但其具体作用机制尚未研究透彻。

本研究从网络药理学的角度出发,发现藤梨根治疗结直肠癌的主要的活性成分是芦荟大黄素(aloe-emodin)、ent-表儿茶素(ent-Epicatechin)、(+)-儿茶素[(+)-catechin]、槲皮素 (quercetin)、谷甾醇 (sitosterol)及β-谷甾醇 (beta-sitosterol)。芦荟大黄素是一种小分子羟基蒽醌类化合物,越来越多的证据表明芦荟大黄素有抗肿瘤活性[8]。相关实研究表明,芦荟大黄素可通过抑制AKT和细胞外受体激酶(ERK)磷酸化来抑制人食管癌细胞长,芦荟大黄素还可通过诱导内质网应激依赖性细胞凋亡、抑制结直肠癌细胞活力、诱导HCT116结肠癌细胞凋亡而治疗结直肠癌[9-11]。表儿茶素和儿茶素属于酚类化合物,有研究已经证明,儿茶素可以通过抑制VEGF的诱导来抑制肿瘤生长、癌细胞侵袭及肿瘤血管生成等[12-13]。另有报道称儿茶素具有很好的抗氧化活性,可以通过直接或间接的抗氧化作用抑制过度氧化应激,促进谷胱甘肽过氧化物酶(GPO)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物质的活化,减少对结肠的氧化损伤[14]。此外,儿茶素还能调节免疫相关细胞的浸润和增殖,如中性粒细胞、结肠上皮细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞,帮助减少炎症反应[15]。此外,儿茶素可以通过调节炎症相关和氧化应激相关细胞信号通路的激活或失活来发挥其抗炎特性,例如核因子κB (NF-κB)通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路、转录因子核因子样2 (Nrf2)通路、信号转导和转录1/3 (STAT1/3)通路等[16-19]。最后,儿茶素还可以通过促进肠道有益菌的增殖,调节肠道菌群的平衡来稳定胃肠微生态环境的结构,从而缓解结直肠癌症状[20]。槲皮素是一种黄酮醇类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗病毒的作用,有研究表明交替摄入β-葡聚糖和槲皮素可显著降低TNF-α水平,并下调与炎症和癌症相关的基因[21]。有报道指出,槲皮素可以降低大肠杆菌、变形菌、肠球菌、梭杆菌的数量,促进双歧杆菌、拟杆菌、梭菌、乳酸杆菌数量,从而促进肠道稳态[22-23]。最近的一项研究报道称,向小鼠补充槲皮素可改善柠檬酸杆菌引起的结肠炎的影响,抑制包括IL-17、IL-6、TNF-α在内的促炎细胞因子的产生,并增加IL-10在结肠组织中的含量,还可通过降低血清二胺氧化酶(DAO)活性和血清D-乳酸含量来改善肠道屏障功能[24]。此外,槲皮素还可以通过调节细胞凋亡和自噬的能力发挥抗癌作用[25]。谷甾醇是一种植物固醇,研究表明其可降低胆固醇水平,增加纤溶酶原激活剂的产生,并具有抗癌的作用[26]。在动物实验中还发现,β-谷甾醇可以浓度依赖性方式降低实验性结肠炎小鼠肠道组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平[27],β-谷甾醇还可通过抑制乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的表达,来恢复耐药性结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性[28]。

PPI网络筛选结果显示,藤梨根治疗结直肠癌的关键靶点有AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、CASP3、IL-1B、EGFR、ESR1等。AKT是鼠胸腺瘤病毒癌基因v-AKT的同源物,位于人类染色体14q32.32,编码 480个氨基酸的蛋白质[29]。AKT1是一种在大多数癌症中过度活跃的原癌基因,是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的重要效应因子,这种蛋白质的基因突变或异常表达可能会改变与癌症发生和进展相关的各种细胞过程[30]。报道称,PI3K/AKT/mTOR通路中的rs10138227 AKT1 基因变异可能与结直肠癌的风险有关[31]。IL-6、IL-1β是一种在免疫细胞和非免疫细胞中均具有多功能的炎性细胞因子,其表达水平与癌症患者的疾病预后呈负相关,可激活STAT3并上调结肠肿瘤细胞中DNA甲基转移酶1(DNMT1)和DNMT3b的表达,从而促进结直肠癌的进展[32]。血管生成是肿瘤的标志并且参与实体瘤的发生,研究表明VEGFA的过度表达与结直肠癌的血管分布、转移和增殖相关,结直肠癌组织中VEGFA可显著上调,其中VEGFA121a/b 和VEGFA165a/b 是主要的亚型[33]。JUN 是一种原癌基因,异位积累时可促进细胞增殖,但可被干细胞因子(SCF)FBXW7泛素化,导致其降解。FBXW7是JUN的E3泛素连接酶,在结肠癌中表现出抑癌作用[34]。Caspases 是一个 15 个成员的半胱氨酸蛋白酶家族,在程序性细胞死亡和炎症中发挥重要作用。研究表明,CASP3不仅有助于抗药性和抗辐射性,还参与调节结肠癌细胞的迁移、侵袭和转移,促进上皮间质转化(EMT)[35]。EGFR是一种在结直肠癌细胞表面过度表达的蛋白质,它可以刺激癌细胞增殖和生存[36]。ESR1是雌激素受体β(ERβ)在恶性结肠上皮中表达的主要雌激素受体形式,与正常组织相比,在结肠肿瘤发生过程中ERβ的表达降低,ESR1表达升高[37]。

本研究GO功能富集分析显示,藤梨根治疗结直肠癌的作用机制主要与转录因子活性、细胞因子活性、血红素结合抗氧化活性、核激素受体活性、转录共调节因子结合泛素样蛋白连接酶等生物过程有关,这表明藤梨根可能通过影响核受体的结合、转录因子活性、激素受体等反应来起到治疗结直肠癌的作用。KEGG通路富集结果分析得到涉及的信号通路主要有AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。AGEs 是晚期糖基化终产物的一种高反应性分子,当葡萄糖或其他还原糖与氨基酸、核苷酸碱基或脂肪酸反应时,内源性或外源性形成AGEs的细胞内功能是通过与RAGE结合来介导的,RAGE是一种跨膜受体,是免疫球蛋白家族的成员[38]。研究表明,RAGE的表达在癌症进展过程中成倍增加,AGE-RAGE 信号的激活也会扰乱细胞氧化还原平衡并调节各种细胞死亡途径,程序性细胞死亡信号导致结直肠癌[39]。HIF可由一些细胞因子和生长因子诱导表达,研究显示抑制HIF-1α的表达可以抑制结直肠癌的发展[40]。同时HIF-α能够激活VEGF促进肿瘤血管的生成,同时在缺氧环境下HIF-1α有助于肿瘤的侵袭性和对放化疗的抵抗力[41],其可能在血管生成和肿瘤进展中通过调节人结直肠癌中的VEGF起作用[42]。前沿研究表明,脂质过氧化过程导致4-羟基壬烯醛(4-HNE)的形成,这是一种上调前列腺素E2(PGE2)活性的化合物,与CRC发展的风险增加直接相关[43]。脂肪组织的高危转化能力是由于产生不同的促炎细胞因子,如TNF-α、IL-6、IL-1β等,研究表明IL-6、IL-1β能改变肿瘤微环境来促进结直肠癌细胞增殖[44],IL-6和TNF-α能够协同激活STAT3及NF-κB 促进结直肠癌细胞的增殖[45]。IL-17的主要来源是辅助型 T淋巴细胞 17 (Th17)的CD4+亚群[46],Th17 细胞的分化和稳定需要多种物质,其中视黄酸孤儿受体-γ(RORγ)和STAT3是负责Th17分化和稳定的转录因子,研究数据显示在结直肠癌患者的血清和肿瘤组织中 IL-17 水平升高[47]。此外,多项研究表明,IL-17在结直肠癌的转移和预后中具有重要作用[48-49],IL-17抑制趋化因子9/10(CXCL9/10)介导的CD8+细胞毒性T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞向结直肠肿瘤的募集,IL-17可激活HT-29人结肠癌细胞中的ERK1/2信号通路,增加IL-17下游基因如基质金属蛋白酶9(MMP-9)、MMP-7、MMP-2等表达[50]。

总之,藤梨根治疗结直肠癌具有多成分、多靶点、多通路的整体调节作用的特点,本研究通过预测藤梨根治疗结直肠癌的潜在作用机制,以期为其活性成分研究以及实验研究提供科学依据。