“粉玉1号”草莓茎尖组织培养体系及其脱毒效果研究

余 红,肖文斐,钱丽华,柳爱春,来文国,汪建荣,李晓媛

(杭州市农业科学研究院,杭州,310024)

草莓(Fragaria×ananassa)为蔷薇科草莓属多年生草本植物,素有“水果皇后”的美称[1]。草莓生产上多以匍匐茎进行无性繁殖,但长期种植匍匐茎苗会引起大量病毒积累。已知感染草莓的病毒有24种,其中草莓皱缩病毒(strawberry crinkle virus,SCV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus ,SMYEV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)造成的危害较重,严重影响草莓产量和品质[2]。目前,对于草莓病毒病尚无有效的治疗方法。根据病毒在受侵染植物体内分布不均匀,顶端分生组织一般无病毒或只携有浓度很低病毒的原理,Morel和Martin(1952)最早通过茎尖培养获得了大丽花无病毒植株,随后茎尖培养脱毒技术在马铃薯、康乃馨等多种经济植物上得到广泛应用[3]。已有报道表明,通过茎尖组织培养脱毒苗是解决草莓病毒积累的有效途径[4-10],而利用RT-PCR技术可对草莓病毒侵染情况进行检测[11-14]。“粉玉1号”是由杭州市农业科学研究院通过杂交育种(香野为母本,2012-W-02为父本)方式选育的早熟抗病粉果草莓新品种,其果实香甜可口、品质极佳,且丰产抗病,综合性状优,具有广阔的发展前景。本研究以“粉玉1号”草莓茎尖为材料,通过对消毒、诱导、继代、生根等培养条件进行探索,筛选适宜的培养基配方及驯化移栽方法,并利用RT-PCR技术对试管苗进行草莓常见病毒检测,建立“粉玉1号”茎尖培养体系,为该品种草莓工厂化育苗及产业化推广提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

2022年5月从杭州市农业科学研究院之江基地大棚栽培“粉玉1号”草莓植株上采集匍匐茎芽。

1.2 外植体消毒

将匍匐茎芽用洗洁精液浸泡1 min,清水冲冼3次,然后在超净工作台上进行消毒。把清洗过的匍匐茎芽用75%乙醇浸泡30 s,再用0.1%升汞溶液浸泡10 min,最后用无菌水冲洗4次。

1.3 茎尖剥取及接种

在超净工作台上,使用Nikon SMZ800双筒解剖镜,用尖头镊子剥取茎尖。对剥取茎尖进行记录,并观察茎尖形态。茎尖剥出后用解剖手术刀片切下大小0.3～0.5 mm的茎尖,茎尖朝上接入初代培养基。

1.4 茎尖初代培养

茎尖初代培养基以MS为基本培养基,分别添加不同浓度(0.1、0.2、0.5 mg/L) 6-苄基腺嘌呤(6-BA),并添加5.5 g/L琼脂粉和30 g/L蔗糖,pH值调至5.8。各处理每重复接种30个茎尖,重复3次。培养温度为23 ℃,每天14 h光照,光照强度为2 500 lx。培养40 d后统计茎尖存活率和茎尖萌发率。

1.5 丛生芽继代培养

茎尖在初代培养基中培养40 d后(长出多片幼叶),转入继代培养基。继代培养基配方为MS+0.1 mg/L 6-BA+5.5 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖,pH值调至5.8。培养条件同初代培养。

1.6 生根培养及移栽炼苗

茎尖培养形成的丛生芽在继代培养基上培养3～4代后,转入生根培养基。生根培养基配方为1/2MS+不同浓度(0、0.10、0.20 mg/L)萘乙酸(NAA)+5.5 g/L琼脂粉+30 g/L蔗糖,pH值调至5.8。各处理每重复接种30个茎尖,重复3次。生根培养20 d后,在室内光照明亮处开盖炼苗3 d,再从瓶中取出幼苗,洗净根部培养基,然后种入盛有基质的穴盘中。基质配方为珍珠岩∶泥炭∶蛭石=1∶1∶1(体积比)。移栽第1周内加盖塑料薄膜保湿。

1.7 常见病毒检测

1.7.1 引物设计 根据GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中草莓皱缩病毒(SCV,AY005146.1)、草莓斑驳病毒(SMoV,AJ311875)、草莓轻型黄边病毒(SMYEV,D12517)、草莓镶嵌病毒(SVBV,NC001725)的基因组序列设计特异性引物,并以草莓肌动蛋白基因Actin(AB116565)作为内参(见表1)。

表1 4种草莓病毒及肌动蛋白的特异性引物

1.7.2 总RNA或总DNA制备 SCV、SMoV和SMYEV为RNA病毒,需利用反转录·聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)进行检测,即提取总RNA进行逆转录后再进行扩增。对DNA病毒SVBV,则可直接用总DNA为模板进行PCR扩增。

取“粉玉1号”茎尖培养试管苗及大棚栽培苗(杭州市农业科学研究院之江基地,外植体取材群体)嫩叶,转移至预冷的研钵中,加液氮迅速研磨成粉末。参照文献[15],采用改进CTAB法提取总DNA。根据AxyPrep总RNA小量制备试剂盒(美国Axygen)说明书进行操作,提取总RNA。取1 μL总DNA或RNA样品,用紫外分光光度检测其纯度和浓度。另取1 μg用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。检测合格的样品保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.7.3 RNA逆转录合成cDNA 试验步骤根据TransScript® First-Strand cDNA Synthesis SuperMix逆转录试剂盒说明书(北京全式金)并进行优化。反应体系组分:Total RNA 5 μL、Anchord oligo(dT)18 (0.5 μg/μL) 0.5μL、Random Primer (N9)(0.1 μg/μL) 0.5 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL、RNase-free Water 3 μL。用置于冰上的200 μL PCR管盛装反应组分,先将RNA模板、引物与RNase-free Water混匀,65 ℃孵育5 min后,立刻冰浴2 min,然后再加其他反应组分,轻轻混匀后,25 ℃ 孵育10 min,42 ℃孵育30 min,然后85 ℃加热10 s失活TransScript RT/RI Enzyme,反应结束后将产物放入-20 ℃保存备用。

1.7.4 PCR检测 将反转录产物cDNA作为PCR扩增模板,每一样品同时进行SCV、SMoV、SMYEV、Actin扩增,而SVBV扩增则直接以总DNA为模板。反应体系为10 μL,其组分分别为模板 1 μL、Primer F 0.5 μL;Primer R 0.5 μL;2×Trans HiFi Mix 5 μL;ddH2O 3 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,58或62 ℃(因引物Tm而异,SCV、SVBV和Actin PCR扩增退火温度为58 ℃,SMoV和SMYEV为62 ℃)退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环30次;72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 茎尖剥取

完整匍匐茎芽见图1-A。剥去1片嫩叶和1片幼叶的芽见图1-B,嫩叶指最外层已转绿的叶,幼叶指被嫩叶包裹尚未转绿的叶。剥去7片幼叶后,直至露出光滑、半透明状的茎尖(见图1C至图1I)。

注:A为匍匐茎芽;B为剥去1片嫩叶和1片幼叶,侧芽与顶芽分开,左侧为侧芽,右侧为顶芽; C为剥去1片嫩叶、1片幼叶及侧芽;D为剥去1片嫩叶、2片幼叶;E为剥去1片嫩叶、3片幼叶;F为剥去1片嫩叶、4片幼叶;G为剥去1片嫩叶、5片幼叶;H为剥去1片嫩叶、6片幼叶;I为剥去1片嫩叶、7片幼叶,露出茎尖(箭头所示)。

2.2 茎尖初代培养

接种的茎尖培养14 d后,茎尖膨大,长出1片幼叶。培养21 d后,茎尖长出2片幼叶。培养26 d后,茎尖长出2片幼叶,其中1片幼叶展开。培养40 d,茎尖长出多片幼叶(见图2)。

图2 草莓‘粉玉1号’茎尖培养过程的形态变化

由表2可见,6-BA对茎尖存活和萌发有较大影响,在0.1～0.5 mg/L浓度范围内,茎尖存活率和萌发率随着6-BA浓度增加而提高。即从茎尖存活率和萌发率来看,都是添加0.5 mg/L 6-BA时最高(见表2)。因此,初代培养时宜添加0.5 mg/L 6-BA。

表2 6-BA浓度对“粉玉1号”草莓茎尖存活及萌发的影响

2.4 继代培养

继代培养时,为了减少变异,将6-BA浓度降低至0.1 mg/L。试验结果显示,将长出多片幼叶的茎尖转入继代培养基,继代培养15 d形成丛生芽(见图2),丛芽生长健壮,无玻璃化现象,平均繁殖系数为2.6。

2.5 生根培养与移栽练苗

表3显示,在含有不同浓度NAA的生根培养基中,“粉玉1号”试管苗的生根率均为100%。其中,NAA浓度为0及0.10 mg/L的根数与根长均无显著差异,当浓度提高到0.20 mg/L时根数与根长均显著下降,根生长受到抑制。因此,生根培养宜不添加NAA。不加NAA生根培养的幼苗,移栽30 d后成活率达90%以上(见图3)。

图3 “粉玉1号”草莓茎尖培养形成的生根苗及练苗移栽后生长情况

表3 不同NAA浓度对“粉玉1号”生根的影响

2.6 常见草莓病毒PCR检测

利用PCR方法,对茎尖培养苗和其对应的取样植株进行病毒检测。由图4可见,茎尖培养苗样品均未检测到SCV、SMoV、SMYEV和SVBV;有1份田间大棚植株样品检测出SVBV病毒。

注:M:DL2000 Plus DNA Marker。+:阳性株对照;-:阴性株对照;1-4:茎尖培养苗样品;5-8:取样植株样品;0:不加模板对照。

3 讨论

在草莓茎尖培养中,剥取茎尖是一个非常细致、繁锁的工作,稍不小心就会破坏茎尖。在本研究中观察发现,草莓匍匐茎芽一般需剥去1片嫩叶和7片幼叶才能剥出茎尖,茎尖在初代培养14 d后开始膨大,培养40 d后可长出多片幼叶。

利用草莓茎尖组培生产脱毒种苗,是草莓良种繁育体系中主要的组成部分,在草莓产业中有着重要的地位[16]。然而,草莓组培由于增殖系数过大、继代次数过多等因素,“丛生苗”“花而不实”“畸形果增多”等不良变异时有发生,严重影响了组培苗在生产中的应用[17]。降低植物生长调节剂总体用量,控制增殖系数是解决草莓组培变异的有效途径之一[18]。本试验发现,在初代诱导培养基中添加0.5 mg/L 6-BA,比低浓度更有利于“粉玉1号”茎尖存活及萌发。在继代培养基中将6-BA添加量降至0.1 mg/L,丛生芽生长健壮且无玻璃化。说明,较低浓度的6-BA已经可以满足“粉玉1号”组培苗的增殖。在生根培养过程中发现,“粉玉1号“试管苗生根非常容易,在不加植物生长调节调剂的培养基中生根率高,根系生长快,且状态好。为减少组培苗生产不良变异,推荐“粉玉1号”茎尖初代培养基采用MS + 0.5 mg/L 6-BA,继代培养基采用MS + 0.1 mg/L 6-BA,生根培养基采用不加植物生长调节剂的1/2 MS。

通过检测“粉玉1号”大棚栽培苗及茎尖培养苗的病毒感染情况发现,在大棚栽培苗(外植体取材群体)中存在草莓镶脉病毒(SVBV)感染,通过茎尖组培可以脱除该病毒。草莓皱缩病毒(SCV)、草莓斑驳病毒(SMoV)和草莓轻型黄边病毒(SMYEV)在本试验所有样品中均未检出,茎尖培养脱除效果这3种病毒的效果还有待进一步验证。