软枣猕猴桃“奇异莓6号”无芽茎段离体再生技术研究

郭慧慧,林丛发,蒋元斌,徐绍翔

(宁德市农业科学研究所,福建宁德,355017)

软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)为猕猴桃科猕猴桃属大型落叶藤本植物[1-2],常用英文名称包括Hardy kiwifruit、Grape kiwi及Baby kiwifruit等[3]。其始载于《开宝本草》,在《本草纲目》中有整株入药的记载[4]。果皮光滑无毛且可食用、果肉细腻酸甜、营养成分丰富、富含维生素C且风味独特[5]。成株具有极强的耐寒特性,我国以东北的软枣猕猴桃资源最为丰富[6]。软枣猕猴桃传统育苗方式主要有播种、扦插和嫁接,但这些方式易受定植时间、气温、病害等外界因素干扰。离体快繁技术对软枣猕猴桃规模化、标准化生产具有重要意义。同时,离体快繁技术也是超低温种质保存、遗传转化、体细胞杂交等的基础。虽然关于软枣猕猴桃离体快繁技术的研究已有较多报道,但都集中在基本培养基、植物生长调节剂及外植体类型等方面,关于光照强度、培养温度、苗龄等培养条件对软枣猕猴桃离体快繁技术的影响尚未见报道。同时,以无芽茎段作外植体时,丛生芽诱导存在分化率及增殖系数低等问题。在张远记等[7]的研究中,无芽茎段外植体容易愈伤化,但其愈伤组织难以分化,分化率仅为27.5%,产生的芽少,生长慢。李昌禹等[8]研究发现,经2,4-D处理的无芽茎段形成愈伤组织后,转至ZT(0.5～4 mg/L)培养基中均形成高矮不等的小植株,但并未给出具体数据。在朴一龙等[9]的研究中,野生软枣猕猴桃无芽茎段的芽分化率为30%。在王广富等[10]的研究中,软枣猕猴桃“魁绿”无芽茎段愈伤组织诱导率为94.7%,不定芽分化率为41.3%。针对此,笔者以软枣猕猴桃“奇异莓6号”无芽茎段为材料,研究了不同光照强度、培养温度、苗龄及植物生长调节剂对其无芽茎段愈伤组织诱导及植株再生的影响,以期为软枣猕猴桃组培苗工厂化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于春季切取长约0.5 cm软枣猕猴桃“奇异莓6号”幼嫩侧芽回实验室。在流水下冲洗30 min以上后,转移至超级工作台进行消毒:75%酒精消毒30 s→无菌水冲洗3次→0.1%升汞消毒10 min→无菌水冲洗5～6次。消毒后,在解剖镜下,用注射器针尖将侧芽外层叶片剥去,切取0.3～0.5 mm大小的茎尖接种在MS+ZT 0.5mg/L中培养。成苗后转入MS+0.2 mg/L IBA中继代培养。切取继代培养无菌苗无芽茎段作外植体。基本培养基为MS固体培养基(含蔗糖30 g/L,琼脂5 g/L,pH值5.8),于121 ℃灭菌20 min。组培室光照为12 h/d。

1.2 丛生芽诱导

1.2.1 植物生长调节剂浓度与配比试验 将培养30 d的无菌苗无芽茎段分别接种在含有不同浓度玉米素(简称ZT,0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/L)和萘乙酸(简称NAA,0.01、0.03 mg/L)的MS培养基中培养。培养室温度为(20±2) ℃,光照强度50 lx。各处理每重复10个外植体,5次重复。55 d后统计愈伤组织诱导率、分化率和不定芽数。愈伤组织诱导率(%)=(产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数)×100%。分化率(%)=(分化的外植体数/产生愈伤组织的外植体数)×100%。不定芽数(个/块)=不定芽总数/分化的外植体数。

1.2.2 光照条件试验 将培养30 d的无菌苗无芽茎段接种在MS(添加2 mg/L ZT)培养基中,分别进行不同光照强度[1 500、50 和0(暗培养)lx]处理。各处理每重复10个外植体,5次重复。培养室温度为(20±2) ℃。55 d后统计愈伤组织诱导率、分化率和不定芽数。计算方法同“1.2.1”。

1.2.3 培养温度试验 将培养30 d的无菌苗无芽茎段接种在MS(添加2 mg/L ZT)培养基中,培养室分别进行不同温度(15、20、25、28 ℃)处理。各处理每重复10个外植体,5次重复。组培室光照强度50 lx。55 d后统计愈伤组织诱导率、分化率和不定芽数。计算方法同“1.2.1”。

1.2.4 苗龄试验 将不同苗龄(培养30 d、60 d、90 d)的无芽茎段接种在MS(添加2 mg/L ZT)培养基中。各处理每重复10个外植体,5次重复。培养室温度为(20±2) ℃,光照强度50 lx。55 d后统计愈伤组织诱导率、分化率和不定芽数。计算方法同“1.2.1”。

1.3 生根培养和移栽

将无芽茎段诱导的丛生芽幼苗转入温度为(25±2) ℃、光照强度为1 500 lx的组培室培养45 d后,切取幼苗分别接种在添加不同浓度IBA(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L)的MS培养基中培养,培养室温度仍为(25±2)℃,光照强度1 500 lx。各处理每重复8个外植体,5次重复。30 d后统计生根率,并用游标卡尺测量根数、根长和根粗。生根率(%)=(生根株数/培养株数)×100%。

由于离体快繁育成的苗木是在无菌、高湿、相对恒温、弱光环境下生长的,在移栽时须炼苗,以提高幼苗的抗性及对外界的适应能力。这是保证移栽成活的第一步。先将生长健壮的组培苗(生根培养30天)移至自然散光下进行移栽前的炼苗,该阶段至少14 d。炼苗期间不开瓶盖。若开瓶盖炼苗,则培养基表面容易长霉菌,根发黑发黄,影响苗质量。分别于1月、3月和6月进行了3次移栽,每次100株苗。1月(19日)移栽时,由于天气较冷,对炼苗后组培苗进行了去叶处理,栽于园土中1个月后可长出新芽,此期间须防治地下害虫。3月(25日前后)移栽时为多雨时期,空气湿度大,气温适宜,组培苗移栽管理最为简单,炼苗后直接移栽,但移栽地须选择不积水地块,否则容易烂苗。6月(10日前后)移栽时,气温相对较高,空气较干,须选择阴凉处移栽,或进行遮荫处理,同时须勤浇水,保证湿度,移栽1个月后组培苗仍较弱,若气温达35 ℃以上,对管理要求较高。每次于移栽60 d后统计成活率。

1.4 数据分析

采用DPS 7.05软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同ZT和NAA浓度对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

对无芽茎段使用不同浓度ZT和NAA进行不定芽诱导,培养40 d两端开始形成淡绿色愈伤组织,培养45 d愈伤组织表面出现红色小点,开始形成不定芽。培养55 d时的统计结果表明,植物生长调节剂种类及浓度对丛生芽诱导有显著影响。随着ZT浓度升高,愈伤组织诱导率、愈伤组织分化率及不定芽数均呈现先升高后降低的变化趋势,当ZT浓度为2 mg/L时到最大值,分别为100%、100%及18.87个/块,显著高于其他处理。当ZT浓度为2 mg/L时,不添加NAA处理的不定芽数显著高于添加NAA处理,说明加入NAA不能促进愈伤组织分化,反而抑制了不定芽形成(见图1和表1)。

表1 ZT和NAA浓度对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响

图1 不同培养基诱导软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段产生丛生芽的情况

2.2 光照条件对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

试验结果看出,在1 500 lx光培养(每天光照12 h)下,随培养时间增加,无芽茎段由绿色转为黑色,期间无愈伤组织产生。50 lx弱光培养(每天光照12 h)40 d,无芽茎段两端开始形成淡绿色愈伤组织,愈伤组织诱导率100%;培养45 d,愈伤组织表面出现红色小点,开始形成不定芽,分化率100%;培养55 d不定芽数为18.87个/块。暗培养50 d,无芽茎段开始形成白色愈伤组织,分化率低,仅12.33%,产生不定芽少,为0.67个/块。弱光培养下软枣猕猴桃无芽茎段丛生芽诱导效果最好(见表2和图2)。

表2 光照条件对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响

图2 不同光照强度下软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的情况

2.3 培养温度对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

观察发现,在15 ℃条件下,无芽茎段一直保持绿色,有少量愈伤组织产生,无分化。在20 ℃条件下培养40 d无芽茎段两端开始形成淡绿色愈伤组织,愈伤组织诱导率100%;培养45 d时,愈伤组织表面出现红色小点,开始形成不定芽,分化率100%;培养55 d时,不定芽数为18.87个/块。在25 ℃条件下培养27 d无芽茎段开始形成淡绿色愈伤组织,愈伤组织诱导率92.50%;培养55 d时,愈伤组织分化率为86.79%,不定芽数为11.63个/块。在28 ℃条件下培养20 d无芽茎段开始形成淡绿色愈伤组织,愈伤组织诱导率82.50%;培养55 d时,愈伤组织分化率为60.56%,不定芽数为5.95个/块。随培养温度升高,茎段出现愈伤时间越早;诱导率、分化率及不定芽数则以在20 ℃条件下时最高(见表3)。综上所述,20 ℃是最佳培养温度。

表3 培养温度对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响

2.4 苗龄对无菌苗无芽茎段诱导丛生芽的影响

由表4可知,苗龄30 d与60 d的无芽茎段培养55 d后,两者的愈伤组织诱导率、分化率及不定芽数均无显著差异,但显著高于苗龄90 d的无芽茎段。可见,最佳苗龄为30～60 d。

表4 苗龄对软枣猕猴桃无菌苗无芽茎段丛生芽诱导的影响

2.5 IBA浓度对生根的影响

由表5可知,添加IBA与否对生根率无显著影响,对根数、根长和根粗均有显著影响。综合考虑根数、根长及根粗3个指标,IBA 0.4 mg/L处理为最佳浓度,在该浓度下培养30 d生根率可达100%,根数为8.53/株,根长1.68 cm,根粗0.14 cm(生根前苗长势见图3,生根后苗长势见图4)。此外,无芽茎段两端愈伤组织产生的无菌苗均正常生根,未观察到极性问题。

表5 IBA浓度对软枣猕猴桃无菌苗生根的影响

2.6 移栽季节对成活率的影响

移栽60 d后调查结果表明,经过炼苗后,于1月、3月和6月移栽的成活率分别为90%、93%和80%。可见,移栽时因气候条件不同,不仅需要采用不同的管理方法,而且移栽成活率也受到一定程度的影响,以3月移栽最适宜。移栽60 d后苗长势见图5。

3 讨论

在植物组织培养过程中,不同植物及其生长状态所需培养条件有差异。光照强度、光照时数、培养基pH值、培养温度、培养湿度、植物生长调节剂、材料年龄等均会在一定程度上影响愈伤组织的形成、继代与再分化。植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化具有重要作用。在软枣猕猴桃愈伤组织诱导丛生芽的研究中,前人使用的植物生长调节剂通常为NAA、6-BA、ZT和IBA等[7-8,11-14]。前人研究表明,低浓度NAA对软枣猕猴桃丛生芽的诱导有促进作用[11-13],但在本研究中NAA却表现为抑制作用,这可能与本研究所用材料长期在MS+0.2 mg/L IBA培养基中继代有关。朴一龙等[9]和郑小华[14]的研究表明,6-BA对不定芽的诱导效果优于ZT,但在本研究前期预试验中6-BA与NAA诱导茎段产生丛生芽的效果均不佳,这可能与所取的外植体生长状态有关。张远记等[7]和李昌禹[8]等的研究结果表明,ZT对软枣猕猴桃愈伤分化有很好的诱导作用,在本研究中ZT亦表现出较好的诱导效果。

前人的研究表明,不同光照强度下愈伤组织的结构和生理状态差异很大[15-18]。暗培养比光培养更有利于愈伤组织诱导和增殖,但长时间暗培养不利于芽生长[19-20]。低光强能使愈伤组织保持健康的生理状态,而高光强对愈伤组织的生长有抑制作用,愈伤褐化严重[21]。本试验获得了相似的结果:暗培养的愈伤组织呈现白色,分化率低,芽点少;弱光培养的愈伤组织为嫩绿色,分化率高,芽点多;强光下,茎段变黑死亡,无愈伤产生。

除光照强度外,外植体的取材时间对组织培养也有影响。如:王春夏等[22]研究发现苗龄短的朱顶红叶片基部容易诱导,朱雪妹等[23]发现番茄“851”苗龄短的外植体愈伤率和生芽率均最高,赵静雅等[24]发现组培苗苗龄大则脱分化和再分化能力较弱。在本试验中,同样是苗龄短的无芽茎段容易诱导。

培养温度可直接影响细胞的生长与分化,从而影响愈伤组织的生长及代谢[25]。李金凤等[26]对高山红景天的研究表明,在较低温度下愈伤组织诱导效果较好,而较高温度不利于愈伤组织诱导。陈发菊等[27]研究发现,低温处理是水母雪莲愈伤组织再分化的关键条件。在本试验中,较低的培养温度(20 ℃)有利于软枣猕猴桃无芽茎段丛生芽的诱导。

在植物组织培养中,外植体的选择相当重要。王梓涵等[28]的研究表明,软枣猕猴桃无菌苗腋芽茎段最佳增殖培养基为MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+6-BA 0.5mg/L,增殖系数可达到9.3。然而,在本试验中观察到,当试验材料为有芽茎段时,芽点生长早于愈伤组织生长,芽生长后会抑制愈伤组织的生长和分化,其增殖率低于无芽茎段。

在生产实践中,本试验建立的软枣猕猴桃无芽茎段快繁技术体系与有芽茎段繁殖技术体系一起应用,可在短期内提供大量优质种苗。