砧木对中华猕猴桃“建香”果实品质的影响

张 鸿,李秀丽,李 毅,陈志伟,乐有章,翟敬华,赵志远,戢小梅

(1 武汉市农业科学院林业果树研究所,武汉,430075;2 武汉大学生命科学学院,武汉,430075)

嫁接是猕猴桃生产过程中最主要的扩繁方式,砧木与接穗之间的互作直接影响成活率、抗逆性、产量和果实品质等[1-2]。有研究发现,砧穗互作对矿质营养、内源激素、信号物质的运输均会产生影响[3],种间嫁接还可能导致DNA甲基化并遗传给下一代[4-5]。我国猕猴桃生产中普遍使用中华猕猴桃Actinidiachinensis和美味猕猴桃A.deliciosa的实生苗作为砧木,其肉质根存在不抗旱不耐涝的问题。近年国内越来越重视猕猴桃砧木筛选及砧穗互作等相关研究。当前我国很多猕猴桃产区开始使用对萼猕猴桃A.valvata作为砧木。刘杨等[6]发现,与美味猕猴桃实生砧处理相比,对萼猕猴桃实生砧“红阳”猕猴桃的果实更大,可溶性固形物含量更高,固酸比更大,口感更好。对萼猕猴桃根系发达,抗旱、耐涝、抗病能力更强,然而,对萼猕猴桃作为砧木会存在嫁接亲和性的问题。针对基砧和接穗亲和性的问题,可通过采用中间砧的办法进行解决[7]。有研究表明,采用适宜的中间砧,能提高甜桔柚的生长势、单果质量及果实总糖含量[8],能提高葡萄(Vitisvinifera)花芽分化能力及提升果实品质[9]。

猕猴桃果实香气物质中主要的醇类、醛类物质为(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯醇、己醇等[10]。“脐红”“金猕”“徐香”“海沃德”“阳光金果”猕猴桃果实香气物质中醛类和酚类物质含量较高,酮类物质较少[11]。李盼盼等[12]发现,“布鲁诺“(Bruno)猕猴桃果实香气物质主要为酯类,并且随着贮藏时间延长,物质种类和含量也会逐渐增加。不同猕猴桃品种之间以及同一品种果实不同发育时期香气组分均不同[13-14]。Cozzolino等[15]对4种黄肉猕猴桃和两种绿肉猕猴桃果实挥发性物质进行了检测,发现2-戊基呋喃是区分黄肉和绿肉的关键物质。吕正鑫等[16]利用顶空固相微萃取与气质联用技术发现,“苌楚2号”“赣猕6号”“赣红7号”“麻毛10号”“麻毛13号”猕猴桃果实香气物质分别有19、30、18、21和26种。在“红阳“猕猴桃果实发育阶段和成熟阶段,典型风味存在差异,挥发物成分由发育阶段的醛类、醇类、酮类向成熟阶段的酯类转变[17]。另外,采收时期[18]、贮藏条件[19]均会影响果实代谢物数量以及种类。可见,目前针对猕猴桃果实香气的研究主要从外源物质、贮藏过程以及品种等方面展开,不同砧木嫁接条件下猕猴桃果实香气物质变化的研究相对较少。在葡萄[20-21]、樱桃(Prunuspseudocerasus)[22]、西瓜(Citrulluslanatus)[23]等作物上的研究表明,砧木能显著影响果实香气代谢物种类和含量。

湖北省猕猴桃生产中所用砧木多为美味猕猴桃实生苗,尚未实现优良砧穗组合的固定搭配。本研究比较了不同砧木“建香”中华猕猴桃A.chinensis‘Jianxiang’的产量、品质、香气组分等,以期为筛选适宜“建香”的优良砧木提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

接穗品种为“建香”中华猕猴桃,采自湖北省恩施州建始县金塘村。砧木类型有3种,均为两年生苗木,分别为“金魁”美味猕猴桃实生苗(以下简称美味砧)、对萼猕猴桃实生苗(以下简称对萼砧)、对萼猕猴桃实生砧“米良1号”美味猕猴桃嫁接苗(以下简称中间砧)。2018年初进行嫁接。果实采样时间为2020年8月。标准品为氯化钠(分析纯,购自国药)和正己烷(色谱纯,购自Merck)。

1.2 试验方法

果样采集及处理:各砧穗组合随机选取3株,在达到果实采收标准(可溶性固形物>7.5%)后,每株树摘取20个果实,每项检测指标随机选取2个果实,每个果实为1个重复,共计6个重复,室温放置至软熟。

果实品质检测:果实软熟后检测单果质量、横径、纵径、侧径、可溶性固形物、干物质、可滴定酸、可溶性总糖、维生素C含量。可溶性固形物含量用手持式糖度计测定。干物质量为果实烘至恒重后的质量,干物质量/鲜质量的比值为干物质含量。可滴定酸测定采用滴定法,NaOH浓度为0.01 mol/L。可溶性总糖采用蒽酮法测定。维生素C含量测定参考Kampfenkel等[24]的方法。以上检测均设定6个重复。

代谢组分析:果实成熟后去掉外果皮和种子,取外层果肉保存于超低温冰箱中。样品从-80 ℃冰箱取出用液氮研磨成粉末,取1 g样品于含有饱和NaCl溶液和10 μL内标溶液(氚代对二甲苯)的20 mL顶空瓶中,用TFE硅胶隔垫密封后进行固相微萃取。在60 ℃温水中预热10 min,预热完成后将一根65 μm的二乙烯基苯/碳纤维/聚二甲基硅氧烷纤维萃取头在60 ℃的样品上部空间暴露20 min。取样后用气相色谱仪(安捷伦7890B-7000D)对挥发性有机物进行定性和定量分析。有机物在进样口处以不分流的模式在250 ℃条件下从纤维涂层中解吸5 min。GC-MS具体条件如下:色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为氦气,流速1.0 mL/min,进样温度250 ℃,检测器温度保持在280 ℃。程序升温条件:初始温度40 ℃保持5 min,以6 ℃/min的速度升到280 ℃,保持5 min。质谱在70 ev电子冲击(EI)电离模式下记录。传输线温度280 ℃,离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃。质谱扫描范围为30～350 amu,扫描间隔1 s。用MassHunter软件对GC-MS的原始数据进行峰提取,获得特征峰的质荷比、保留时间、峰面积等信息,基于MWGC数据库对样本代谢物进行定性和定量分析。

1.3 数据分析

对代谢物数据进行归一化处理后用MetaboAnalyst 4.0进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)和变量投影重要性(Variable Importance in Projection,VIP)分析。

2 结果与分析

2.1 砧木对果实理化指标的影响

在单果质量、横径、纵径和侧径方面,对萼砧及中间砧显著高于美味砧,其单果质量分别增加57.37%和39.37%,对萼砧及中间砧之间无显著性差异(见图1)。可见,对萼砧或者中间砧能较大程度地提高“建香”果实大小。

图1 砧木对“建香”中华猕猴桃的单果质量等理化指标的影响

对萼砧的果实干物质含量和可溶性固形物含量最高,分别为18.07%和20.2%。中间砧的果实可溶性总糖、维生素C含量最高,可滴定酸含量最低,对萼砧的果实次之(见图1)。可见,中间砧能在一定程度上提高“建香”果实品质。

2.2 砧木对果实挥发性代谢物的影响

3种砧木的“建香”果实共检测到105种挥发性代谢物,包括萜类、醇类、芳烃类、酚类、醛类、酮类、烷烃类、烯烃类、酯类、杂环类化合物以及其他类型化合物(图2)。对香气贡献较大的代谢物有4-蒈烯、1-乙烯基-3,5-二甲基-苯、苯甲酸甲酯、己醇、醋酸酐、丁酸乙酯、己酸乙酯、丁酸甲酯等,以酯类物质居多。

图2 “建香”中华猕猴桃果实香气物质种类构成

从化合物种类来看,“建香”嫁接在3种砧木上都能检测出105种代谢物,无差异。不同砧木处理共计有43种代谢物的相对含量差异显著,主要为萜类、酮类和醛类物质。中间砧能促进果实代谢物积累,尤其对于芳烃类及部分酮类、萜类的积累具有显著促进作用;对萼砧的“建香”果实代谢物积累水平普遍低于另外两种砧木;美味砧对“建香”果实代谢物积累的影响介于中间砧和对萼砧之间(见表1)。

表1 不同砧木“建香”中华猕桃果实部分挥发性代谢物相对含量 CPS(Count Per Second)

对检测到香气化合物归一化处理后进行主成分分析(PCA)。不同砧穗组合PCA得分如图3A所示,主成分1和主成分2共解释了51.8%的变异率。在无监督的模式下,不能将美味砧、中间砧、对萼砧“建香”果实区分开。正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)结果显示,在有监督模式下两两比较时,组间差异较明显,均分别位于横轴左右两端(见图3B、3C、3D),即砧木种类显著性影响了“建香”果实挥发性代谢物的形成。为了验证分组模式下数据模型是否有效,对上述OPLS-DA模型进行假设验证,检验次数为100次。验证结果显示,p值均小于0.05,且Q2、R2的值也证明该模型有效。统计学分析表明,当VIP>1时,该因子可能是两组之间的差异物质。结合相关性分析得到的p值分析,当VIP>1且p<0.05时,该代谢组分就是这个模型下两组的差异代谢物。为进一步验证不同处理之间具体存在哪些差异物质,对3组材料中各个代谢物的VIP值进行了预测,发现3组处理有43种差异代谢物(见图4)。其中,中间砧组中有28种代谢物上调,主要是1-(3-甲基苯基)-乙酮、2-(3-甲基-2-丁烯基)环戊酮等酮类、2,4-庚二烯醛、2,4-辛二烯醛等醛类和(+)-香芹酮、对苯三酚等萜类物质,有9种代谢物含量下降;对萼砧处理共有30种代谢物含量下调,10种上调。说明,中间砧能促进“建香”果实挥发性代谢物积累,而对萼砧不利于“建香”果实挥发性代谢物积累。

注:(A)不同砧木嫁接的“建香”香气PCA得分图;(B)嫁接在美味和中间砧上的“建香”香气OPLS-DA得分图;(C)嫁接在美味和对萼上的“建香”香气OPLS-DA得分图;(D)嫁接在中间砧和对萼上的“建香”香气OPLS-DA得分图。MW:美味砧木样本,ZJZ:中间砧样本,DE:对萼样本,图4同。

图4 不同砧木“建香”中华猕猴桃果实香气组成成分的VIP值图

3 讨论

3.1 不同砧木影响猕猴桃果实大小与内在品质

本研究发现,中间砧和对萼砧在果实大小方面均显著优于美味砧,且中间砧与对萼砧之间无显著差异。这可能是不同砧木合成的内源激素含量不同,从而达到影响果实大小的效果[25]。刘杨等[6]研究发现,相比传统的美味猕猴桃实生砧,对萼砧能促进“红阳”猕猴桃主蔓和新梢增粗,提高单果质量,提升树势,实现丰产性。闫树堂等[26]的研究结果表明,矮化中间砧对苹果果实内源激素含量、果实大小有显著性影响。可见,砧木类型及砧穗组合会影响猕猴桃果实大小。

本研究发现,在内在品质,如可溶性总糖、可滴定酸和维生素C含量方面,中间砧“建香”的表现显著优于另外两组,美味砧和对萼砧之间的差异不显著。有研究表明,砧木根系类型会影响接穗对水分和营养物质的吸收,不同砧木对离子、矿质营养的吸收及向上运输的能力有差异,因此能改变接穗部无机营养含量,从而影响果实品质[25,27]。与中华猕猴桃和美味猕猴桃相比,对萼猕猴桃的根系更发达,对养分、水分吸收及运输能力更强,因而以对萼猕猴桃为砧木能提高接穗养分含量及改善果实品质。Thorp等[28]将“Hort 16A”嫁接在8种砧木上并测定叶片、茎段和果实中的营养元素,发现砧木对叶片和果实中的营养元素累计影响显著,且呈正相关关系。王海宁等[29]研究了不同砧木嫁接的富士苹果对N素的吸收、分配及利用情况,发现不同砧穗组合中同一器官C、N素分配差异显著。此外,砧木还能影响接穗光合作用能力,影响光合产物向果实中转移,从而对果实品质产生影响。如:长果猕猴桃(A.longicarpa)做“红阳”猕猴桃砧木能提高净光合速率、水分利用效率、光能利用效率和羧化效率[30]。

3.2 不同砧木影响猕猴桃果实香气品质

砧木会影响果实香气物质。本研究发现,砧木在“建香”猕猴桃果实香气物质代谢积累上起着重要作用,不同砧木的果实代谢物含量有显著性差别。在3种砧木中,对萼砧最不利于代谢物的累积,中间砧处理的代谢物含量最高。牛自勉等[31]研究发现,矮化中间砧能显著提高苹果果实中酯类物质含量。“泰山嘎拉”/M26/八棱海棠组合果实的醛类、酯类及香气含量均显著高于“泰山嘎拉”/八棱海棠组合果实[32]。整体来看,以中间砧为砧木能较大程度地提高果实中挥发性代谢物的含量。这可能是因为中间砧能提高基砧和接穗间物质交流能力,提高无机营养向上部运输的效率,影响各种酶类的活性,如分别与酯类、醛类密切相关的脂氢过氧化物裂解酶和醇酰基转移酶,影响猕猴桃果实成熟过程中由醛类物质转化为酯类物质的过程,从而导致香气物质含量差别较大。Zhang等[33]以“赤霞珠”葡萄为材料,发现砧木能影响果皮花色苷、黄酮醇、二苯乙烯类代谢物含量及其相关合成酶基因表达量,从而增加果皮抗氧化活性。

有研究发现,在总醇类、萜类、醛类、酮类和酯类中,成熟阶段猕猴桃果实香气物质以酯类化合物数量最多,且丁酸甲酯、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯和苯甲酸乙酯是成熟果实中丰度最高的成分[34]。在本研究中,成熟“建香”猕猴桃果实香气物质种类以烷烃类和酯类物质占比最高,分别为24%和22%;从含量上来看,酯类物质含量最高,对香气的贡献最大。

酯类是引起猕猴桃甜味和果味的主要化合物,丁酸乙酯被认为是果实成熟后果香的重要来源。猕猴桃果实代表香气属性包括果香、甜香、青草味、黄瓜味等,在猕猴桃成熟期间其味道从草青味逐渐变为青鲜味、果味,这是果实内醛类物质含量降低而酯类增加导致的[35]。猕猴桃果实香气属性与丁酸乙酯、己酸甲酯和苯甲酸己酯含量有关,己烯醛和己醇能赋予青草香,丁酸乙酯等酯类与甜味相关性较高,苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯具有花香气息[36-37]。有研究表明猕猴桃香气的关键组分包括丁酸乙酯、己酸乙酯、癸醛、己醇、1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-酮[37],也有研究认为一些含硫物质如三硫化物、二甲基硫醚为猕猴桃重要成分[38]。在本研究的所有105种代谢物中,酯类是对“建香”果实香气贡献最大的一类物质,其中,丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸甲酯、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯的贡献度较高。因此,“建香”成熟果实的香气总体表现为果香、甜香和花香气息。猕猴桃发育阶段和未成熟阶段的代谢物主要为醇、醛以及酸类物质,成熟阶段会转变为酯类物质。在本研究中,未检测到1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-酮以及含硫物质,另外,被认为是决定猕猴桃香味三种挥发性成分之一的2-己烯醛也未能检测到,这可能是遗传因素以及果实发育阶段导致的差异。

4 结论

与美味猕猴桃(“金魁”)实生砧相比,中间砧(对萼猕猴桃+美味猕猴桃品种“米良1号”嫁接苗)及对萼猕猴桃实生砧能显著提高“建香”猕猴桃果实单果质量,后两者之间无显著性差异。中间砧能显著提高“建香”猕猴桃果实可溶性糖和维生素C含量,降低可滴定酸含量,同时,对果实香气代谢物含量表现出显著促进作用。综合评价果实大小、内在品质以及香气物质,以对萼猕猴桃+“米良1号”为“建香”的砧木能显著提升果实品质。