维生素K2 单独及与钙剂联合使用对斑马鱼骨骼健康的改善作用及机制研究

孙 怡，夏洪志，牛 堃，李江波，朱宇雷，李古月，尹忠燕

（南通励成生物工程有限公司，江苏南通 226010）

骨质疏松是一种常见的骨骼疾病，其特征为骨量下降，骨脆性增加[1]。随着人口老龄化的加剧，骨质疏松发病率呈逐年上升态势[2-3]，此外，由其导致的骨折并发炎症，对中老年人的生活质量、生命安全具有极大的影响[4-5]。现代研究表明，维生素K2可通过激活维生素K 依赖蛋白将无机钙与有机蛋白结合成骨基质，从而提高骨密度[6-7]。此外，也有研究报道维生素K2对骨质疏松，特别是绝经后骨质疏松具有很好的改善作用，可以减少患者骨量丢失，降低骨折风险[8-11]。现其作为食品添加剂、营养补充剂，已被广泛用于保健食品、功能食品等。然而，维生素K2及其在与钙剂联合用药时其改善骨质疏松效果及作用机制研究相对较少，缺乏有效的理论支撑。

斑马鱼作为一种脊椎动物，具有胚胎透明易观察、易饲养、易实现高通量筛选等特点，斑马鱼与哺乳动物在骨发育过程中具有相似的同源性调控因子，如成骨细胞发育涉及Wnt/β-连环蛋白、TGF-β和Hedgehog 信号等关键蛋白[12]、参与骨形成的关键调控因子包括osterix、runx2a/b、col10a1和骨连接素7 等[13]。因此，由于其基因组和人类基因组的高同源性，且其骨骼发育机制的高度保守性，已成为近年来研究骨骼发育和疾病的重要模式生物[14-15]。

糖皮质激素被广泛用于骨质疏松动物模型的构建[16-19]，传统的骨形态观察方法为化学染色法，常用的染料为茜素红、钙黄绿素、阿利新蓝等[20-22]，然而，由于其存在操作过程复杂、耗时长、染料稳定性差等问题[23]，对实验结果的稳定性和真实性具有较大的影响。近年来，随着基因编辑技术日渐成熟，转基因品系的实验动物模型被广泛用于疾病模型构建，如表达增强绿色荧光蛋白（eGFP）的转基因斑马鱼Tg（ola.sp7:nlsGFP）已经被研究者用来研究斑马鱼骨骼的发育[19,23]。采用泼尼松龙诱导转基因品系的斑马鱼骨质疏松模型，可导致斑马鱼细胞外基质、成骨细胞和破骨细胞相关基因表达发生异常，可视化观察到斑马鱼骨骼荧光面积及荧光光密度的降低，从而实现抗骨质疏松活性成分的高通量快速评价[24-25]。

因此，本文基于泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，研究维生素K2单独使用及与钙剂联合使用，对骨质疏松斑马鱼骨骼发育状态的改善作用，以及其对斑马鱼成骨细胞、破骨细胞、细胞间质等关键基因表达水平的影响，为维生素K2及与钙剂联合用于抗骨质疏松时的作用机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿色荧光标记成骨细胞转基因斑马鱼Tg（ola.sp7:nlsGFP）幼鱼 山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台孵化；维生素K2（纯度80%）、D3油（质量浓度25000 μg/mL）、氯化钙 南通励成生物工程有限公司自制；泼尼松龙、依替膦酸二钠 源叶生物科技有限公司；FastPure®cell/tissue total RNA isolation Kit V2、HiScript®II Q RT supermix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ universal SYBR qPCR master mix 试剂盒 南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

DP2-BSW 图像采集系统 日本Olympus 公司；AXIO ZOOM.V16 体视荧光显微镜 德国Carl Zeiss 公司；DS-200 高速组织捣碎机 江苏江阴科研仪器厂；Centrifuge 5804 R 超低温离心机 德国Eppendorf 股份有限公司；C1000 TouchPCR 仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Forma 3111 型水套式CO2培养箱 美国Forma 公司；斑马鱼养殖饲养设备 北京爱生科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 斑马鱼胚胎的获取 斑马鱼的养殖和繁殖参照Westerfield 法[26]。取卵前一日，雌雄鱼分开，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体（Artemia nauplii）。照明14 h/黑暗10 h 交替进行，第2 d 光照开始前将雌雄鱼（1:2 或1:1）并池，光照后获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水（含5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4）中，28 ℃下控光培养。

1.2.2 维生素K2及与钙剂联合使用的抗骨质疏松活性评价 参考 Huang 等[23]报道的方法，并对造模浓度进行了优选，具体评价方法如下：选用健康成骨细胞绿色荧光标记的转基因斑马鱼（ola.sp7:nlsGFP）作为实验对象，在胚胎发育至1 dpf 时，使用1.0 mg/mL链酶蛋白酶E 溶液脱去卵膜，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼幼鱼，移入24 孔培养板中，设置空白对照组（Control）、模型组（PD）、阳性对照组和各药物处理组。各实验组用水均为胚胎培养用水，除空白对照组不加入泼尼松龙处理外，其余各实验组均加入质量浓度为7.5 μmol/L 的泼尼松龙溶液。阳性对照组（ED）加入质量浓度为100 μg/mL 的依替膦酸二钠溶液处理，D3和CaCl2联合处理阳性对照组（D3+CaCl2）加入质量浓度为0.5 μg/mL 的D3溶液以及质量浓度为2 mg/mL 的氯化钙溶液。维生素K2药物处理组设置低、中、高三浓度，低浓度处理组（VK-1）维生素K2的浓度为5 μg/mL，中浓度处理组（VK-2）维生素K2的浓度为10 μg/mL，高浓度处理组（VK-3）维生素K2的浓度20 μg/mL。D3、钙剂和维生素K2联合处理组也设置低（D3+CaCl2+VK-1）、中（D3+CaCl2+VK-2）、高（D3+CaCl2+VK-3）三浓度，在加入质量浓度为0.5 μg/mL 的D3、2 mg/mL 的氯化钙的基础上，分别加入质量浓度为 5、10 和20 μg/mL 维生素K2，每组10 条斑马鱼，同时设置2 个复孔，加培养水至2.0 mL。然后加盖，分别将各实验组斑马鱼置于光照培养箱（28 ℃）让胚胎继续发育至5 dpf，使用麻醉剂麻醉斑马鱼，显微镜下观察斑马鱼荧光细胞情况并拍照，利用Image-Pro Plus 软件计算斑马鱼头部骨骼中成骨细胞荧光面积和荧光密度，利用GraphPad Prism 6.0 软件对结果进行统计，根据公式（1）计算药物处理的相对改善骨骼健康能力。

1.2.3 维生素K2及与钙剂联合使用的抗骨质疏松作用机制研究 按照1.2.2 中的给药方案处理斑马鱼后，收集斑马鱼，用PBS 清洗斑马鱼幼鱼3 次，去除表面残留，收集各组斑马鱼幼鱼，按照总RNA 提取试剂盒说明书要求，进行总RNA 提取，测定RNA 浓度，采用反转录试剂盒，将RNA 逆转录为cDNA，随后进行Real-time PCR 扩增，扩增条件为：95 ℃预变性10 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40 个循环。以β-actin 为内参基因，检测alp、runx2a、sox9a、bmp2b、bmp4、opg、rank1、trap、ctsk、vdrb、sparc、colla2基因的表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列设计Table 1 Primer sequence list

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，实验结果表示为平均值±标准误差（x¯±SEM）。组间差异比较采用单因素方差（one-way ANOVA）进行显著性分析。P<0.05 认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 维生素K2 及与钙剂联合使用的抗骨质疏松活性评价

发育5d 的斑马鱼幼鱼，头部骨骼主要由软骨、脑颅和咽骨架三部分构成[27]，其中麦可尔软骨（mandible，MD）、鳃条骨（branchiostegal rays，BR）、匙骨（cleithrum，CB）和鳃盖骨（opercle）为早期骨化评价指标[27]。维生素K2及与钙剂联合使用对骨质疏松斑马鱼头部骨骼发育的影响如图1 所示，由斑马鱼头部骨骼表型图可知，泼尼松龙可抑制斑马鱼头部骨骼MD、BR、CB 以及opercle 的发育，通过加入维生素K2及与钙剂复合物，可以直观观察到斑马鱼头部骨骼荧光面积和荧光亮度的变化。D3和CaCl2组合物可加速斑马鱼头部鳃条骨发育，在实验浓度条件下，可观察到4 条鳃条骨，维生素K2在浓度为20 μg/mL 时也有相同的效果，此外，维生素K2与D3和CaCl2联合使用时，该复合物对鳃条骨以及匙骨发育呈现明显促进作用，随着维生素K2浓度的增高，可明显观察到斑马鱼鳃条骨数量从三条增加到六条、匙骨荧光亮度明显增强。

图1 维生素K2 及与D3 和CaCl2 联合用药对斑马鱼骨骼发育的影响Fig.1 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on osteoblast development of zebrafish

通过对斑马鱼头部骨骼的荧光面积和荧光密度的数据进行统计，可以更加客观地评价维生素K2及与D3和CaCl2联合使用的抗骨质疏松活性。药物对斑马鱼头部骨骼荧光面积、荧光密度的影响如图2、图3 所示，由实验结果可知，PD 模型组与Control组相比，斑马鱼成骨细胞荧光面积（P<0.0001）和荧光密度明显减少（P<0.0001），表明由泼尼松龙诱导的骨质疏松模型成功；与模型组相比，阳性对照组依替膦酸二钠、D3和CaCl2组合物均能显著提高斑马鱼成骨细胞荧光面积（P<0.05，P<0.0001）和荧光密度（P<0.001），表明模型结果可信。在实验浓度范围内，维生素K2及与D3和CaCl2联合使用能显著改善由泼尼松龙诱导的斑马鱼成骨细胞荧光面积（P<0.05）和荧光密度减少（P<0.001），且呈现出一定程度的剂量依赖性。此外，维生素K2通过与D3和CaCl2组合物联合使用，发挥协同效应，使其骨骼细胞荧光面积显著强于空白对照组（P<0.0001），在维生素K2浓度为20 μg/mL 时，其与D3和CaCl2联合使用可使斑马鱼成骨细胞荧光强度显著增强（与空白组相比，P<0.001），结合表型图结果可知，维生素K2与钙剂组成的复合物对斑马鱼骨骼荧光面积和荧光密度显著增强与鳃条骨的快速发育以及匙骨荧光密度增强有关。该现象也出现在淫羊藿素处理的铁过载诱导的骨质疏松斑马鱼中，其可显著促进斑马鱼骨骼发育[28]。淫羊藿素为临床上常用于骨质疏松疾病治疗的淫羊藿的有效成分，结果表明，维生素K2与D3和CaCl2联合使用表现出极强的抗骨质疏松活性。

图2 维生素K2 及与D3 和CaCl2 联合用药对斑马鱼成骨细胞荧光面积影响的统计结果Fig.2 Statistical results of the effect of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on fluorescence area of zebrafish osteoblasts

图3 维生素K2 及与D3 和CaCl2 联合用药对斑马鱼成骨细胞荧光密度影响的统计结果Fig.3 Statistical results of the effect of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on fluorescence density of zebrafish osteoblasts

各实验组的相对改善骨骼健康能力的测定结果如图4 所示，在实验浓度范围内，维生素K2单独处理可使骨质疏松斑马鱼骨骼状态恢复到与正常斑马鱼发育状态的60%～87%左右，D3和CaCl2组合物对斑马鱼骨骼状态的改善能力约是空白组的2 倍，维生素K2与D3和CaCl2联合使用可显著提升改善骨骼健康的能力，约是空白组的4 倍左右，结果进一步证明维生素K2与D3和CaCl2联合使用可充分发挥协同效果。

图4 各给药组的相对改善骨骼健康能力统计结果Fig.4 Statistical results of relative ability to improve bone health in each administration group

2.2 维生素K2 及与钙剂联合使用的抗骨质疏松作用机制研究

以成骨细胞发育相关的基因alp、runx2a、sox9a、bmp2b、bmp4为检测因子，测定各药物组对斑马鱼成骨生成相关基因表达水平的影响，结果如图5 所示，由实验结果可知，在实验周期内，造模药泼尼松龙可以显著下调斑马鱼机体内alp、bmp2a和bmp4基因的表达（P<0.01），显著提升runx2a和sox9a基因的表达（P<0.0001），可能的原因为机体对泼尼松龙导致的runx2a和sox9a基因过度抑制从而产生的一种补偿效果。D3和CaCl2组合物可以显著改善泼尼松龙对alp和bmp2a基因抑制效果（P<0.001），显著抑制泼尼松龙导致的runx2a和sox9a基因上调（P<0.0001）。维生素K2以及维生素K2与D3和CaCl2联合使用，在实验浓度范围内可以显著改善泼尼松龙对alp和bmp2a基因抑制效果（维生素K2浓度为20 μg/mL 组除外）（P<0.05），显著抑制泼尼松龙导致的runx2a和sox9a基因上调（P<0.0001）。此外，维生素K2在5～10 μg/mL 时，可以显著提升泼尼松龙导致的bmp4基因的下调（P<0.05）。ALP 活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志[20]，bmp2a和bmp4为成骨细胞分化过程中关键因子[29]，因此，维生素K2通过逆转泼尼松龙导致的成骨细胞生成相关的alp、bmp2a和bmp4基因下调，从而改善骨形成状态。

图5 维生素K2 及与D3 和CaCl2 联合用药对斑马鱼成骨发育相关基因的影响Fig.5 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on genes related to osteogenesis in zebrafish

以斑马鱼破骨生成相关基因opg、rank1、trap、ctsk为评价指标，测定维生素K2及与钙剂联合处理对其表达水平的影响，结果如图6 所示，由实验结果可知，在实验周期内，造模药泼尼松龙可以显著促进斑马鱼机体内opg、rank1、trap和ctsk基因的表达（P<0.01），D3和CaCl2组合物可以显著抑制泼尼松龙对opg和ctsk基因上调效果（P<0.0001）。在实验浓度范围内，维生素K2及与D3和CaCl2联合用药可显著改善泼尼松龙对rank1基因上调效果（P<0.01），维生素K2单独给药可显著改善泼尼松龙对ctsk基因上调效果（P<0.01），在维生素K2及与D3和CaCl2联合用药浓度为20 μg/mL 才能显著改善泼尼松龙对ctsk基因上调效果（P<0.0001）；维生素K2在浓度为5 μg/mL 时可显著改善泼尼松龙对opg基因上调效果（P<0.0001），当维生素K2及与D3和CaCl2联合用药时，其在药物浓度为5 μg/mL 时表现出更强的下调opg基因表达水平的能力（P<0.0001）。此外，维生素K2通过与D3和CaCl2联合用药，在低浓度组处理时（5 μg/mL）可以显著改善泼尼松龙导致的trap基因的上调（P<0.01）。破骨细胞是维持骨稳态的重要指标[24]，TRAP 是鉴定破骨细胞的关键因子[20]，泼尼松龙可诱导破骨细胞分化激活，从而导致上调opg、rank1、trap、ctsk基因表达，从而导致骨质疏松。因此，维生素K2通过抑制破骨细胞激活相关基因的表达，从而调节骨吸收状态。

图6 维生素K2 及与D3 和CaCl2 联合用药对斑马鱼破骨发育相关基因的影响Fig.6 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on genes related to osteoclast development in zebrafish

以斑马鱼细胞外基质中骨钙化相关基因vdrb、sparc、colla2为检测指标，各基因表达水平结果如图7 所示，由实验结果可知，在实验周期内，造模药泼尼松龙可以显著抑制斑马鱼机体内vdrb、sparc和colla2基因的表达（P<0.0001），D3和CaCl2组合物可以显著改善泼尼松龙对vdrb基因下调效果（P<0.05）。在实验浓度范围内，维生素K2可显著提升vdrb（维生素K2浓度为20 μg/mL 组除外）、sparc和colla2基因表达水平（P<0.01），维生素K2及与D3和CaCl2联合用药后在低浓度时就可显著改善泼尼松龙导致的colla2基因表达下调（P<0.0001），然而，联合用药后，仅在中浓度组可促进vdrb基因表达上调（P<0.05），在低浓度组可促进sparc基因表达上调（P<0.01）。vdrb是一种维生素D 受体转录因子，能调节体内钙或磷酸盐的吸收，sparc和colla2基因不仅参与骨形成，还能够促进游离钙离子结合能力，恢复和维持骨骼矿化，加快骨重建[16,24]，因此，维生素K2抗骨质疏松活性的发挥离不开其上调细胞外基质中骨钙化相关基因vdrb、sparc、colla2表达的能力。

图7 维生素K2 及与D3 和CaCl2 联合用药对斑马鱼细胞外基质骨钙化相关基因的影响Fig.7 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on genes related to bone calcification in extracellular matrix of zebrafish

综上，维生素K2及与D3和CaCl2联合使用，通过调节骨形成、骨吸收、细胞外基质间转录因子的动态平衡，发挥抗骨质疏松作用。

3 结论

本文通过对不同浓度维生素K2及其与钙剂联合处理下，骨质疏松斑马鱼的成骨细胞荧光面积、荧光密度以及成骨细胞生成、破骨细胞生成、抑制细胞外基质中骨钙化相关基因表达水平的变化，进行分析比较，明确维生素K2在5～20 μg/mL 安全浓度范围内，能显著改善由泼尼松龙诱导的斑马鱼成骨细胞荧光面积和荧光密度的降低，其与D3和CaCl2联合使用时，发挥协同作用，显著促进斑马鱼成骨细胞荧光面积的增多。维生素K2可通过促进成骨细胞生成相关的alp、bmp2a和bmp4基因的表达、抑制破骨细胞生成相关的opg、rank1、trap、ctsk基因的表达以及促进细胞外基质中骨钙化相关基因vdrb、sparc、colla2表达从而发挥抗骨质疏松活性。

维生素K2与骨组织代谢息息相关，其不仅对骨形成具有促进作用，还可以对骨吸收起到抑制作用，还能调节细胞外基质因子，从而维持骨发育动态平衡，其单独或是与其他钙剂联合使用，对泼尼松龙诱导的骨质疏松具有很好的改善效果。当前后疫情时代，国民健康意识显著提升，健康预防理念更加深入人心，此外，随着人口老龄化的加剧，骨健康类产品需求将呈现上升态势，因此，维生素K2作为一种安全的食品添加剂和功能原料，单独使用或是与钙剂联合使用，作为抗骨质疏松和改善骨骼健康的保健食品、功能食品的功能因子，将有广阔的市场前景，本文研究结果将为促进骨骼生产健康产品的研发提供理论基础。