不同温度对离土浙贝母贮藏品质及酶活性的影响

林旭东，董翼飞，凌建刚，朱 麟,

（1.宁波市农科院农产品加工研究所，浙江宁波 315000；2.国家蔬菜加工技术研发专业中心，浙江宁波 315000；3.宁波市农产品保鲜工程重点实验室，浙江宁波 315000；4.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866）

浙贝母（Fritillaria thunbergiiMiq）系百合科、贝母属中一种多年生草本植物，原产于浙江宁波象山，主产地在浙江且在浙江省的种植面积占全国总面积的90%，产值近9 亿元[1]。浙贝母中主要含有生物碱、多糖、皂苷和挥发性成分[2]，具有镇痛止咳[3-4]、抗炎抑菌抗氧化和抗癌抗肿瘤等功效[2,5-6]，它不仅作为传统中药，还用做功能性食品[7]，如浙贝母含有20%的直链淀粉，在加工过程中极易转化成对人体有益的抗性淀粉，对人体肠道有益。

浙贝母采收季节通常在每年的5 月份，此季节多阴雨天气且室内外温度较高，而且采后其鳞茎水分含量较高，酶活性较强并且生理代谢旺盛，当被采收离开土地后其贮藏期会变得非常短暂，很容易发霉变质。经查阅文献发现，目前还没有关于采后浙贝母贮藏方式的研究。传统上，大多采用将浙贝母种鳞茎留地或土埋的方法进行贮藏，以防止贮藏期间其鳞茎发生腐烂。但该方法操作繁琐、受气候和储藏环境影响较大，容易造成浙贝母鳞茎的品质损失。研究表明，低温贮藏可以有效延长采后农产品的贮藏期[8-9]。其中，贮藏温度是农产品保持良好品质的重要条件，不当的贮藏温度会对农产品的品质和货架期产生不良的影响[10-11]。低温贮藏一直是延缓果蔬成熟和腐烂的有效技术，其在秋葵[12]以及杏鲍菇[13]等农产品中应用广泛。但是，目前还没有关于离土浙贝母低温贮藏的报道。果蔬类农产品对温度敏感，贮藏温度过高保鲜效果不明显，而温度过低会对果蔬产生冷害并引起生理紊乱，确定适宜的贮藏温度对保持离土浙贝母的品质和减少采后损失具有重要的意义。

因此，本文以成熟的浙贝母鳞茎为材料，采用0、5、10、20 ℃四个贮藏温度，来比较在不同贮藏温度条件下浙贝母的理化品质如失重、色泽、硬度、总生物碱含量、总多糖含量、过氧化物酶（POD）活性、多酚氧化酶（PPO）活性以及超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化，以选择出浙贝母的最佳贮藏温度解决其离土贮藏困难的问题，为下一步浙贝母的贮藏保鲜奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浙贝母鲜鳞茎 取自宁波市海曙区章水镇浙贝母种植基地，取样时间为2022 年5 月，室外温度30 ℃，采购后运回实验室进行贮藏实验；总生物碱含量试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、过氧化物酶（peroxidase，POD）试剂盒和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）试剂盒 均购自苏州格锐思生物科技有限公司；甲醇、无水乙醇 分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；三氯甲烷 分析纯，杭州高晶精细化工有限公司；木瓜蛋白酶（100000 U/g）

食品级，东恒华道生物科技有限公司；苯酚 分析纯，上海克林生化科技有限公司。

ReadMax 1900/1900Pus 型酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司；Spectrumlab 紫外可见分光光度计 上海力申科学仪器有限公司；125D-1CN 型十万分之一电子分析天平 德国Sartorius 公司；VS10-300C 型超声波清洗器 沃信仪器制造有限公司；DK-S24 型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；TA.XT plus 质构仪 北京鑫奥依克光电技术有限公司；Frontier™ 5000 型微量高速离心机 美国Ohaus；X-Rite CI60 色差仪 爱色丽（上海）色科技有限公司。

1.2 实验方法

将浙贝母分为12 组，每组30 个，分别放置在0、5、10 和20 ℃条件下贮藏，贮藏前对其硬度、色泽、总生物碱含量、总多糖含量、MDA 含量、POD、PPO 以及SOD 的活性进行测定。之后每15 d 从四个温度梯度中各随机挑选30 个浙贝母对其理化性质进行测定，测定周期为90 d。

1.2.1 失重率测定 采用差量法计算。按照下式计算失重率[14]。

式中：m1—贮藏前样品质量，g，m2—贮藏后样品质量，g。

1.2.2 感官评价 取样后，对浙贝母进行感官评定。评定时，品评人员对浙贝母的色泽、气味、组织饱满度以及霉变程度4 个方面进行评价，最后通过统计总分进行分析。各项指标分别为好、较好、一般、较差和差5 个等级，分值分别为10、8、6、4、2 分，满分40 分。分数在32～40 表示产品质量较好；分数在24～32，表示产品质量良好，无明显变化；感观评分低于16 分产品品质发生明显变化，达到货架期终点。由20 名品评人员（男女各半）作为感官评价小组，对浙贝母进行感官评价，具体标准见表1。

表1 浙贝母感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Fritillaria thunbergii Miq

1.2.3 色泽分析 从每组样品中随机选取10 个浙贝母，然后将其切开，使用X-Rite CI60 色差仪对其果皮的六个部位（上、下、前、后、左和右）的色差进行测定，每个部位测定三次，其中L*值表示明度，L*值越大，表示亮度越大；a*值正数代表红色，负数代表绿色；b*值正数代表黄色，负数代表蓝色，色泽测定选在相同自然灯光下进行。

在农业供给侧结构性改革背景下和“三农”问题的进一步推进下，农村市场主体多样化生产经营模式对于金融产品和服务的需求增大，当前的农村金融无法满足改革发展的需要，需要加快农村金融创新，将农村金融创新发展作为一项系统工程，构建现代化的金融体系，满足农村多样化的金融需求，解决农村金融供给不足及效率不高的问题。

1.2.4 硬度分析 采用TA.XT 质构仪测定各处理组浙贝母硬度。样品前处理：随机挑选10 个直径为5 cm 左右的无损浙贝母，洗净晾干，分别在头部、中部和尾部选取平整处进行测试。探头选择：选用直径2 mm 的P/2 圆柱形探头。参数设定：设置参数为测试前速度1 mm/s，测试速度5 mm/s，测试后速度5 mm/s，位移10 mm。每个样品进行6 次重复，取平均值。

1.2.5 总多糖含量测定 总多糖含量的测定根据汪少华等[15]的方法并稍加修改。

标准曲线绘制：准确称取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖标准品10.00 mg 于100 mL 容量瓶中。分别吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 葡萄糖标准溶液，用蒸馏水补至1.00 mL，先后加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 浓硫酸，摇匀冷却，室温放置20 min 后于490 nm 波长测定其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程y=0.85824x+0.04438，决定系数R2=0.9981。

总多糖含量的测定：吸取多糖溶液1.00 mL，然后依次加入1.00 mL 的5%的苯酚溶液、5.00 mL 的浓硫酸，摇匀冷却，室温放置20 min 后于490 nm 波长测定其吸光度值。根据标准曲线计算多糖含量。

1.2.6 总生物碱含量、丙二醛（MDA）含量、多酚氧化酶（PPO）活性、过氧化物酶（POD）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 测定时将浙贝母组织切碎，称取约0.20 g 组织于5 mL 试管中，加入2 mL提取液冰浴匀浆，4 ℃下离心（10000 r/min）10 min，保留上清液，然后根据试剂盒说明进行操作。分别测定其SOD 活性、POD 活性、PPO 活性、总生物碱含量和MDA 含量，每个样品重复3 次，结果取平均值。

1.3 数据处理

采用Origin 2021 软件进行数据计算和作图，使用SPSS 17.0 软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度对浙贝母失重率的影响

失重率是衡量浙贝母贮藏品质的重要指标，失重主要是由于浙贝母水分的蒸腾作用以及呼吸作用消耗体内营养物质造成的。失重率达到一定程度时，会导致浙贝母萎蔫，影响其药用价值[16]。贮藏期间浙贝母失重率变化见图1。

图1 不同贮藏温度下浙贝母失重率变化Fig.1 Changes of weight loss of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.2 不同贮藏温度对浙贝母感官评分的影响

果皮色泽、气味、组织饱满度以及霉变程度能反映出贮藏期间浙贝母品质的变化。浙贝母在不同贮藏条件下感官评分变化如图2 所示。从图中可以看出，浙贝母在20 ℃条件下可以贮藏45 d，10 ℃条件可以贮藏60 d，而0 和5 ℃条件下贮藏90 d 其品质依然饱满无变质。不同贮藏条件下的浙贝母感官评分均随贮藏时间的延长而降低，然而四个贮藏条件下浙贝母感官品质变化存在着明显差异，与5、10和20 ℃相比，0 ℃下的浙贝母感官变化相对较平稳。贮藏至75 d 时，20 ℃条件下的浙贝母感官评分已经低于14 分，而且表皮已经发生严重的霉变，可见其品质已经严重劣变，丧失了药用和经济价值。而贮藏至90 d 时，0 ℃的感官评分为28 分，其品质状态良好。方差分析表明，在贮藏过程中，0 ℃与5、10 和20 ℃具有显著性差异（P<0.05）。可见0 ℃条件可以更好地保持浙贝母的感官品质，从而延长其货架期。

图2 不同贮藏温度下浙贝母感官评分变化Fig.2 Changes in sensory scores of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.3 不同贮藏温度对浙贝母色泽的影响

如图3 所示，三个图（a、b、c）展示了不同贮藏温度下浙贝母色泽L*、a*、b*的变化趋势，从图中可以看出三个指标的变化趋势有所差异。其中L*值呈现下降的趋势，贮藏前浙贝母皮的L*值为54.60，在前45 d 四个温度下浙贝母的L*值下降较快，后期L*值变化缓慢。其中10 和20 ℃下贮藏的浙贝母果皮亮度变化明显。方差分析表明，0 ℃与5 ℃有显著性差异（P<0.05），与10 和20 ℃具有极显著性差异（P<0.01）。图3b 中，四种条件下的浙贝母a*值呈上升趋势，与贮藏时间成正相关。贮藏15 d 后，10 和20 ℃条件下的a*值明显高于0 和5 ℃。表明贮藏温度越高，浙贝母果皮颜色向红方向变化越快。方差分析显示，0 ℃与5 ℃的a*值变化基本无显著性差异（P>0.05），与10 和20 ℃具有显著性差异（P<0.05）。图3c显示，四个贮藏温度下的浙贝母的b*值均呈下降趋势。浙贝母常年生长在泥土里，贮藏前其果皮呈现黄色或淡黄色，而随着贮藏时间的不断延长，浙贝母水分丧失愈加严重并且出现不同程度的霉变，导致浙贝母的表皮颜色变黑变暗，黄色逐渐衰退，因此b*值不断下降。其中10 和20 ℃变化较0 和5 ℃明显（P<0.05），说明温度越高，浙贝母水分损失越大，浙贝母细胞壁遭受破坏严重，增加了果皮的自身色素的氧化分解，从而导致b*值下降[17]。由此可知，0 ℃贮藏可以有效抑制浙贝母色泽的变化从而具有良好的保鲜效果。

图3 不同贮藏温度下浙贝母色泽变化Fig.3 Changes in color of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.4 不同贮藏温度对浙贝母硬度的影响

硬度是评价果蔬品质的重要指标，可以客观反映果蔬的成熟状态和品质状态。不同贮藏温度下浙贝母的硬度变化见图4。如图4 所示，贮藏过程中，浙贝母硬度呈不断下降的趋势。贮藏前15 d，0 和5 ℃条件下浙贝母硬度与贮藏前相比无明显变化，而10 和20 ℃条件下变化较为明显，可能是因为低温环境抑制其呼吸作用，降低其新陈代谢，从而更好地维持了浙贝母的硬度。在整个贮藏过程中，0 ℃条件下浙贝母的硬度始终大于其它贮藏条件。方差分析表明，贮藏过程中，0 ℃与5、10 和20 ℃具有显著性差异（P<0.05），原因可能是低温环境抑制了浙贝母机体水分的流失，以及蛋白质、多糖等大分子成分的降解，更好地抑制了机体的萎蔫软化并且更好地保持细胞壁的张力，从而更有利于其硬度的保持。

图4 不同贮藏温度下浙贝母硬度变化Fig.4 Changes in hardness of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.5 不同贮藏温度对浙贝母总多糖含量的影响

多糖是浙贝母中公认的有效成分之一，浙贝母多糖有良好的清除体外自由基的作用，具有较好的抗氧化功效[1-2]，是中草药研究的重点。如图5 示，浙贝母多糖含量呈现先增加后减少的趋势，前30 d，随着贮藏时间的增加多糖含量呈增加的趋势，贮藏至30 d 时，四种温度下的浙贝母多糖含量比贮藏前分别增加了39.70%、40.44%、26.97%和36.41%。可能原因是浙贝母从室外高温环境转入室内后，其相对较低的温度有助于解除浙贝母的休眠[18]，从而促进了多糖的合成。在贮藏30 d 后，多糖含量随之减少且贮藏温度越高多糖含量减少越多，并且贮藏至90 d时，在10 和20 ℃下贮藏的浙贝母多糖含量低于贮藏前。可能因为浙贝母在10 和20 ℃条件下呼吸作用强；另外，由感官评价可知，贮藏温度高更有利于霉菌等微生物的滋生，其在生长过程中以多糖作为营养物质，从而导致多糖含量下降[19]。

图5 不同贮藏温度下浙贝母多糖含量变化Fig.5 Changes in polysaccharide content of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.6 不同贮藏对浙贝母总生物碱含量的影响

生物碱是存在于生物体内的含氮有机化合物，大多数存在于植物中。浙贝母中的生物碱，如贝母素甲、贝母素乙、西贝素苷以及蒲贝酮碱等甾体生物碱能够镇痛止咳，而且贝母素甲和贝母素乙还具有抗肿瘤功效[20-21]。不同贮藏温度条件下浙贝母的总生物碱含量变化见表2。

表2 不同贮藏温度下浙贝母总生物碱含量变化Table 2 Changes in total alkaloid content of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

如表2 所示，随着贮藏时间的不断增加，浙贝母总生物碱含量整体上呈不断增加的趋势，不同贮藏时间和贮藏温度下的生物碱含量具有显著性差异（P<0.05）。与贮藏前相比，在0、5、10 和20 ℃条件下贮藏90 d，浙贝母总生物碱含量分别增加了12.36、7.82、7.08 和6.14 倍。浙贝母在贮藏期间总生物碱含量呈不断上升的趋势，可能原因是低温环境促进了浙贝母休眠期的解除，使其活性恢复[18]。浙贝母适宜的生长温度是20～25 ℃[22]，贮藏在20 ℃条件下的浙贝母在贮藏15 d 后有芽体产生，其总生物碱含量显著高于0、5 和10 ℃贮藏条件下的浙贝母（P<0.05）。低温环境抑制了浙贝母的活性，贮藏在10 和20 ℃条件下浙贝母优先发芽，因此在贮藏前期总生物碱含量较高。在贮藏后期，0 和5 ℃条件下的总生物碱显著高于10 和20 ℃条件下的总生物碱含量（P<0.05），因为10 和20 ℃贮藏条件下温度相对较高，浙贝母在此贮藏条件下长时间贮藏，过多的失重和不同程度的发霉变质导致浙贝母生理活性减弱，总生物碱含量不断下降。

2.7 不同贮藏温度对浙贝母丙二醛含量的影响

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是由于生物体感官衰老或逆环境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，是细胞衰老的一种表现[23]。如图6 可知，贮藏前15 d 浙贝母MDA 含量变化不明显，其中20 ℃含量最高，达到了2.47 nmol/g，比贮藏前增加了0.75 nmol/g。贮藏到90 d 时，10和20 ℃的浙贝母MDA 值分别是贮藏前的3.15 和3.78 倍。随着贮藏时间增加浙贝母MDA 含量不断增加，且表现为温度越高增加的越多，主要原因是在贮藏过程中浙贝母组织腐烂变质从而导致MDA 含量升高，并且贮藏温度越高加剧了浙贝母膜脂过氧化[24]。MDA 作为膜脂过氧化的最终产物，其含量的增加能够抑制细胞保护酶活性和降低抗氧化物的含量，加剧膜脂的过氧化，从而加速浙贝母组织的衰老进程[24]。方差分析表明，0 ℃与10 和20 ℃具有极显著性差异（P<0.01），与5 ℃有显著性差异（P<0.05），在整个贮藏过程中0 ℃贮藏条件下浙贝母的MDA含量最低、且变化较为平稳，表明0 ℃贮藏条件有效延缓浙贝母组织的衰老进程，有利于新鲜状态的保持。

图6 不同贮藏温度下浙贝母丙二醛（MDA）含量变化Fig.6 Changes in malondialdehyde content of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.8 不同贮藏温度对浙贝母多酚氧化酶和过氧化物酶活性影响

PPO 是一种含铜氧化酶，能够催化酚类与O2氧化成醌类，使组织形成褐变，是引起浙贝母褐变的主要原因之一[25]。如图7a 所示，不同贮藏温度下的浙贝母PPO 活性呈现先下降后上升的趋势，且低温环境明显抑制了多酚氧化酶活性。在贮藏前15 d，PPO活性呈略微的下降趋势，原因可能是浙贝母从室外高温的环境转移到低温环境条件下，机体受到低温刺激而产生应激反应，该趋势与徐莉等[26]研究的在不同温度条件下枇杷的PPO 活性变化趋势相一致。而从贮藏15 d 到90 d PPO 活性不断升高，贮藏温度愈高PPO 活性也越高，可能是因为高温胁迫造成浙贝母组织结构和功能丧失，使结合态PPO 转变为游离态，从而使其活性增大[27]。方差分析表明，0 和5 ℃无显著性差异（P>0.05），但0 ℃条件下PPO 活性保持得更低。由此可知，0 ℃较好地抑制了浙贝母的PPO 活性，有利于浙贝母的贮藏保鲜。

图7 不同贮藏温度下浙贝母多酚氧化酶（a）和过氧化物酶酶（b）活性变化Fig.7 Changes in polyphenol oxidase activity (a) and peroxidase activity (b) of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

POD 活性与果蔬等的成熟和衰老密切相关，其活性增加代表着果蔬进入衰老阶段，成熟度增加，褐变增加[28]。如图7b 所示，浙贝母的POD 变化呈先降低后增加的趋势，该趋势与杨光等[29]的研究结果相一致。贮藏前15 d 可能是浙贝母受到低温的刺激而导致POD 活性有所下降。15～30 d POD 活性迅速增加。贮藏到60 d 时10 和20 ℃条件下浙贝母POD活性达到最大值，其中20 ℃的POD 活性最高，是贮藏前的2.49 倍。

2.9 不同贮藏温度对超氧化物歧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶是一类金属酶,它可以清除组织中活性氧，维持活性氧的代谢平衡，防止细胞遭受超氧阴离子自由基的毒害，保护细胞膜结构的完整和正常生理功能[30]。由图8 可知，浙贝母的SOD 活性呈先上升后下降的趋势，该变化趋势与李志刚等[13]的研究相一致。贮藏前期（45 d），四个贮藏温度下的浙贝母SOD 活性不断增大，其活性分别比贮藏前提高了15.35%、11.31%、14.03%和15.82%，而且在此时10 和20 ℃下的浙贝母SOD 活性以达到最大值，这在保护细胞以及延缓细胞衰老发挥了重要作用。上升原因可能是浙贝母从室外高温被转移到室内低温条件下进行贮藏，环境条件的改变使SOD 被激活以抵御外界环境对浙贝母品质的破坏[31]。达到峰值之后，SOD 活性开始下降，可能是在贮藏期间细胞内的活性氧含量不断升高，细胞内自由基清除系统被破坏，从而导致SOD 活性下降[32]。与5、10 和20 ℃相比，0 ℃条件下的浙贝母SOD 活性保持得更高且变化较为平稳。可见，低温可以较好地保持SOD 活性，减少超氧阴离子自由基对组织和细胞的破坏。

图8 不同贮藏温度下浙贝母超氧化物歧化酶活性变化Fig.8 Changes in superoxide dismutase activity of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

3 结论

从实验结果可知，不同的贮藏温度对浙贝母的感官品质、酶活性、多糖含量以及总生物碱含量有显著的影响，并且在0 ℃条件下浙贝母的各项生理生化指标保持的更加稳定。0 ℃有效抑制了脂膜氧化产物丙二醛含量以及多酚氧化酶和过氧化物酶酶活性的上升，从而延缓了浙贝母的衰老和腐败进程。与10 和20 ℃相比，0 ℃可以显著减少贮藏过程中的浙贝母的失重（P<0.05），更好地保持浙贝母的色泽和硬度，从而使其在贮藏过程中保持有更好的感官和质地。在贮藏过程中，四个贮藏温度下的浙贝母超氧化物歧化酶活性和总多糖含量均呈先上升后下降的趋势，但是与其他贮藏条件相比，0 ℃更好地保持了SOD 的活性，从而使浙贝母在贮藏期间保持较稳定的氧自由基清除能力从而抑制其脂膜氧化进程，并且有效抑制了总多糖含量的降低从而减少浙贝母的药用成分的损失。

综上，适宜的低温环境可以有效地提高浙贝母的保鲜效果，延长浙贝母的贮藏期。本实验为解决浙贝母离土贮藏困难的问题，以及下一步浙贝母的贮藏保鲜研究奠定基础。