液相色谱-质谱/质谱法测定植物源性产品中强极性杀菌剂三乙膦酸铝残留

祝子铜，雷美康，姜芝英，黄超群，叶有标，陈玉娇，韩 超

（1.衢州海关综合技术服务中心，浙江衢州 324003；2.杭州海关技术中心，浙江杭州 310016；3.浙江树人学院，生物与环境工程学院，浙江杭州 310015）

三乙膦酸铝（Fosethyl-AL）俗名疫霉灵、乙磷铝等，是一种广谱、低毒、安全的磷酸盐类内吸性杀菌剂，有双向内吸传导作用。它对霜霉属、疫霉属引起的病害有良好的防治效果，是目前国内外防治多种果蔬霜霉病应用较多的药剂，适用于水稻、蔬菜、瓜类等作物[1]。随着该类杀菌剂的登记、推广和使用，该类农药残留问题逐渐被人们所关注，欧盟、美国和日本等国家和地区对该类农药制定了残留限量标准。欧盟规定三乙膦酸铝在蘑菇、谷物、油料作物等植物源性食品中的最大残留限量分别为2、2、2 mg/kg[2]；美国规定三乙膦酸铝在柑橘类、葡萄、番茄中的最大残留限量分别为9、10、3 mg/kg[3]；日本规定三乙膦酸铝在蘑菇、花生中的最大残留限量分别为0.5、0.5 mg/kg[4]。我国最新颁布的食品安全国家标准GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》规定了黄瓜、苹果、葡萄、荔枝中的最大残留限量分别为9、10、10、3 mg/kg[5]。随着这些法规的实施，急需建立配套的测定植物源性食品中三乙膦酸铝杀菌剂的方法。

目前国内外公开报道的关于三乙膦酸铝杀菌剂分析手段主要有气相色谱法[6]、液相色谱-质谱/质谱法[7-10]、离子色谱-质谱/质谱法[11-12]。气相色谱法需要先采用三甲基硅重氮甲烷在恒温下对三乙膦酸铝进行衍生化，在密闭反应瓶中用氢氧化钠碱解三乙膦酸铝生成乙醇，然后通过气相色谱法测定衍生化或碱解后的产物，从而对三乙膦酸铝进行定量。文献报道的液相色谱-质谱/质谱法分析三乙膦酸铝的方法仅仅针对菠菜[7]、橄榄油[8]、葡萄[9]、甘蓝[10]等部分基质，对其他果蔬类、谷类及油料类作物无相关研究，方法中均采用基质标准曲线外标法进行定量测定，针对不同种类的样品需要制备不同的空白基质液，存在工作量大、空白基质不易获取等问题。本研究采用乙腈进行的提取，以液相色谱-质谱/质谱法结合同位素内标法，提高了工作效率，定量的准确度。本研究采用番茄、甘蓝、葡萄、金针菇、大米、花生不同植物源性食品为研究对象，扩充了方法的应用范围。该分析方法能满足欧盟、美国、日本等国家的法规要求，助力农产品安全的出口，同时能满足GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》标准中限量要求，对行政执法、国内抽检风险监测提供技术方法支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄、甘蓝、葡萄、金针菇、大米、花生 购自本地市场（浙江衢州），取代表性样品约500 g，将其可食部分先切碎，经多功能食品搅拌机充分捣碎均匀，试样均分为两份，装入洁净容器，密封，并标明标记，于-18 ℃以下冷冻存放；乙腈、甲酸、甲醇 色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司；HLB 固相萃取柱（500 mg，6 mL）、0.22 μm 有机滤膜、无水硫酸镁、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水 由超纯水仪制得；标准物质：三乙膦酸铝、三乙膦酸铝-D15纯度>98.0%，德国Dr 公司。

PURELAB-Chorus 超纯水仪 英国ELGA 公司；AB 4500 Q TRAP 液相色谱-质谱/质谱仪 美国AB SCIEX 科技有限公司；Multifuge X1R 离心机美国赛默飞世尔科技有限公司；T18 高速匀浆机、MS3 basic 漩涡振荡器 德国IKA 公司；AL204 分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；N-EVAP-24 氮吹仪 美国Organomation 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 称取经捣碎均匀的试样（番茄、甘蓝、葡萄、金针菇）10 g（精确到0.01 g）于50 mL 离心管中，加入200 μL 10 μg/mL 同位素内标中间液，加入20 mL 乙腈，采用T18 高速匀浆机以9000 r/min均质1 min，在20 ℃下以8000 r/min 离心5 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中，残渣中再加入15 mL乙腈，涡旋1 min，以8000 r/min 离心5 min，合并上清液至50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，待净化。

称取5 g 试样（大米、花生，精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入200 μL 10 μg/mL 同位素内标中间液，加入5 mL 水，静置30 min，加入20 mL 乙腈，用均质机以9000 r/min 均质1 min，以8000 r/min 离心5 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中，残渣中再加入15 mL 乙腈，涡旋1 min，以8000 r/min 离心5 min，合并上清液至50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，待净化。

HLB 固相萃取柱依次用5 mL 甲醇5 mL 50%甲醇溶液活化，取2 mL 待净化液至已活化的HLB固相萃取柱中，接收上样液，再用3 mL 乙腈洗脱，接收洗脱液，洗脱液于45 ℃下氮吹至近干，用水定容至2 mL，涡旋，过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

1.2.2 标准溶液的配制 储备液：分别准确称取准适量的标准物质和同位素内标标准物质，用10%乙腈溶液分别配制成浓度为1000 μg/mL 标准储备液和同位素内标储备液，于4 ℃避光保存。

中间液：分别准确移取适量的标准储备液和同位素内标储备液，用10%乙腈稀释配制成浓度为10 μg/mL 的标准中间液和同位素内标中间液，于4 ℃避光保存。

标准工作溶液：准确移取标准中间液适量和同位素内标中间液适量，用10%乙腈溶液稀释至20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0 ng/mL 的标准工作溶液。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 液相色谱条件 色谱柱：AQ-C18柱，2.1 mm×150 mm（内径），粒度3 μm，流动相：A 相为甲醇；B 相为0.15%甲酸溶液；柱温30 ℃；流速：0.1～0.2 mL/min；进样量20 μL；液相色谱流速及梯度洗脱见表1。

表1 液相色谱流速及梯度洗脱程序Table 1 HPLC flow rate and gradient elution procedure

1.2.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子化（ESI）负离子模式；电喷雾电压：-4500 V；气帘气压力：30 psi；离子源温度：550 ℃；雾化气压力：55 psi；辅助气压力：55 psi；碰撞气：Medium；多反应监测扫描（MRM）采集参数见表2。

表2 三乙膦酸铝质谱参数Table 2 Spectrometric parameter for fosetyl-aluminium

1.3 数据处理

采用Analyst software 1.7（美国AB SCIEX 科技有限公司）软件进行数据采集，MultiQuant 3.0.2 软件进行数据处理和标准曲线建立。回收率及精密度采用Microsoft Office Excel 2007 软件进行计算。回收率的计算均采用六个平行样品去平均值计算。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的优化选择

2.1.1 色谱柱的选择 三乙膦酸铝为强极性物质，需要采用能够保留强极性物质的特殊色谱柱[13-14]，一般的C18反相液相色谱柱很难将其保留。查阅参考文献，AQ C18色谱柱[15-16]和Hypercarb 色谱柱[17-19]能够用于强极性物质的保留，试验比较了2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18柱和Hypercarb 2.1 mm×100 mm 5 µm 色谱柱，Hypercarb 2.1 mm×100 mm 5 µm 色谱柱可以将三乙磷酸铝进行保留，但是峰形拖尾。而2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18色谱柱是一款耐100%水相的色谱柱，该色谱柱填料有适度的表面覆盖率和完全的封尾，对于高含水量流动相具有很好的兼容性，对有机酸等强极性化合物具有较强的保留能力，能够将三乙磷酸铝进行保留且峰形尖锐。图1 为使用2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18色谱柱三乙膦酸铝标准溶液色谱图。因此选择使用2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18柱作为分析柱。

图1 三乙膦酸铝标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of fosetyl-aluminium standard solution

2.1.2 流动相的选择 参考文献[20-22]，试验对比了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.15%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.15%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液作为流动相的分离效果。以三乙膦酸铝色谱峰的峰形、保留时间（Rt）、信噪比作为参考，对各流动相分离效果进行比较。

三乙膦酸铝在溶液中解离形成乙基磷酸阴离子，使得三乙膦酸铝在电喷雾离子源（ESI）离子化时形成[M-H]-的准分子离子峰。推测在流动相中加入一定浓度的甲酸会对乙基磷酸的响应有一定的抑制，但是同时添加甲酸会使乙基磷酸以分子的形式存在，使乙基磷酸的峰形更加对称。由图2 可以看出，流动相为甲醇-水时，三乙膦酸铝色谱峰前伸，峰形不对称。流动相为乙腈-水时，三乙膦酸铝色谱峰异常的窄，色谱峰采集的点数比较少，导致色谱峰面积不稳定，重现性不好。流动相加入甲酸后，三乙膦酸铝峰形变得尖锐对称。因此选择使用加入甲酸的溶液作为流动相。

图2 不同流动相条件下三乙膦酸铝色谱图Fig.2 Chromatogram of fosetyl-aluminium in different mobile phase

实验比较了甲醇-甲酸溶液、乙腈-甲酸溶液作为流动相，色谱峰的信噪比数据。由图2 和表3 可以得出，当使用甲醇-0.15%甲酸溶液作为流动相时，三乙膦酸铝色谱峰峰形尖锐对称、分析时间合适、信噪比明显较高。因此选择甲醇-0.15%甲酸溶液作为流动相。

表3 三乙膦酸铝标准溶液在不同流动相条件下信噪比数据Table 3 Signal to noise ratio of fosetyl-aluminium in different mobile phase

2.2 质谱参数的建立

三乙膦酸铝在溶液中是以乙基磷酸阴离子的形式存在，可在负源条件下离子化，因此选用ESI-模式，乙基磷酸形成[M-H]-准分子离子峰，作为母离子。采用1 μg/mL 待测化合物的标准溶液，分别以流动注射的方式进行母离子全扫描，确定乙基磷酸的母离子质量数。确定好母离子后分别对喷雾电压、蒸发温度、毛细管温度、气帘气流速、辅助气流速、雾化气流速行优化。优化好喷雾电压、蒸发温度、毛细管温度、气帘气流速、辅助气流速、雾化气流速之后，分别对各目标化合物进行子离子及碰撞能量优化，从中选出子离子丰度最高的碰撞能量作为最佳碰撞能量，选择两个丰度比较高、稳定性好的子离子作为定性和定量离子，建立多反应监测（MRM）模式。三乙膦酸铝详细质谱参数如表2 所示。优化后的条件见“1.2.3”项下仪器条件。图3 为三乙膦酸铝及其同位素内标在优化后的液相色谱条件和质谱参数下采集的色谱图。

图3 三乙膦酸铝及其同位素内标多反应监测色谱图Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatography of fosetyl-aluminium and fosetyl-aluminium-D15 standard solution

2.3 提取条件的选择

三乙膦酸铝为强极性化合物，在溶液中以乙基磷酸阴离子的形式存在，根据工作经验及分析比较目前已发表的文献选择乙腈、1%乙酸乙腈、1/1 乙腈溶液、1%甲酸甲醇等溶液进行提取。实验后发现乙腈的提取效率最好，单点校正回收率在90%以上；乙腈对于植物源食品表现了很好的渗透性和较高的提取效率，同时又对蜡类、脂肪等非极性成分的提取能力较弱。最终选择以乙腈为提取溶液，既可以减少植物源食品中的色素，同时目标物的回收率满足《GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》、Method validation and quality control procedures for pesticides residue analysis in food and feed 相关规定[23-24]。

2.4 净化条件的选择

固相萃取、分散固相萃取等几种方法是常用的净化方法。用于三乙膦酸铝的固相萃取柱有HLB、C18固相萃取柱。分散固相萃取剂有C18、PSA、GCB、Florisil 等。GCB 能有效去除样品中的色素，对于深色的果蔬具有较好的净化效果。Florisil 适用于从非极性的基液中萃取极性化合物，如胺类、羟基类及含杂原子或杂环的化合物，但是去除色素的能力较弱；PSA 与NH2柱作用效果类似，均可吸附提取液中的极性化合物（如碳水化合物、色素）、有机酸、酚类；C18柱对水相基质中的大部分有机物都能产生保留。实验比较了HLB 小柱，150 mg 无水硫酸镁、25 mg PSA、75 mg GCB 几种净化方法。经实验比较，HLB 固相萃取柱可有效去除基质；150 mg 无水硫酸镁、25 mg PSA、75 mg GCB 对于色素的去除效果较好，但是回收率偏低。因此，本研究选用HLB小柱进行净化。

2.5 标准曲线和定量限

取按“1.2.2”项下制备好的标准工作液，以“1.2.3”项下的条件进行测定，以目标分析物的浓度与同位素内标浓度比值为横坐标，以目标分析物的峰面积与同位素内标峰面积比值为纵坐标，进行回归分析。三乙膦酸铝杀菌剂在20.0～800.0 ng/mL 范围内呈良好的线性关系。

该方法的定量限由空白样品添加目标分析物进行回收试验获得，按“1.2.2”项下的条件进行处理，“1.2.3”项下的条件进行测定，以10 倍信噪比（S/N>10）为定量限，结果见表4。本实验结果显示，定量限均能满足欧盟[2]、美国[3]、日本[4]和食品安全国家标准GB 2763-2021《食品中农药最大残留限量》[5]的限量值要求。

表4 三乙膦酸铝的线性数据及定量限Table 4 Linear test results and LOQ of fosetyl-aluminium

2.6 回收率和精密度

测定本方法的回收率和精密度，实验选用番茄、甘蓝、葡萄、金针菇、大米、花生等作为样品基质，添加不同量的三乙膦酸铝杀菌剂标准溶液，每个添加水平均做6 个平行样，加标水平及回收率、精密度结果见表5。

表5 回收率与精密度（n=6）Table 5 Mean recovery rate and precision (n=6)

2.7 方法基质效应

取空白番茄基质样品，按“1.2.2”项下方法制得空白基质溶液，用空白基质溶液将混合标准中间液稀释至20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0 ng/mL。另取混合标准中间液，用10%乙腈溶液稀释至20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0 ng/mL。将上述基质标准工作液和纯溶剂标准工作液分别进样，绘制标准曲线方程。使用上述两条标准曲线分别对不同添加浓度的番茄基质加标样品进行校正。回收率数据见表6，从表6 中可以得出使用纯溶剂标准曲线进行校准，三乙膦酸铝回收率低于50%。而使用基质标准曲线进行校正，三乙膦酸铝回收率在87.4%～118.7%。说明样品基质对三乙膦酸铝有较明显的基质抑制，降低基质效应的方法有通过更进一步的净化、采用基质标准曲线、对上机溶液进行稀释、采用同位素内标法等[25-26]。本研究采用同位素内标标准曲线进行定量，可以有效地降低基质效应的影响。表6 为纯溶剂标准曲线和番茄基质标准曲线校准后回收率数据。

表6 纯溶剂标准曲线和番茄基质标准曲线校准后回收率（n=6）Table 6 Recovery rate of pure solvent calibration and tomato matrix-matched calibration (n=6)

2.8 实际样品测定

在市内农贸市场购买2 份番茄、1 份甘蓝、2 份葡萄、1 份金针菇、1 份大米、1 份花生等实际样品，利用本文建立的液相色谱-质谱/质谱法结合同位素内标进行测定，购买的样品中均未检出三乙膦酸铝。

3 结论

本研究采用液相色谱-质谱/质谱法结合同位素内标法，针对番茄、甘蓝、葡萄、金针菇、大米、花生等多种植物源性产品无需制备不同的空白基质液和配制基质标准曲线，提高了工作效率，解决了空白基质不易获取等实际检测问题。该方法采用乙腈进行提取，经HLB 固相萃取小柱净化，采用AQ C18柱色谱柱分离，以甲醇和0.15%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.1～0.2 mL/min。质谱采用多反应监测负离子扫描模式，同位素内标标准曲线法定量。三乙膦酸铝在20.0～800.0 ng/mL 范围内线性良好，决定系数为0.9904。三乙膦酸铝定量限为100.0 μg/kg。对6 种植物源性产品进行3 个水平加标回收试验，平均回收率范围为69.6%～112.3%，相对标准偏差为1.0%～9.8%，能够满足欧盟、美国、日本以及我国等国内外法规中对该药物的最大残留限量要求。