不同感官特性酱香型大曲理化指标与霉菌群落关联分析

唐佳代，石雨菲，赵益梅，王怡，冷枝，郭敏，孟卓妮，杨亮

（茅台学院酿酒工程系，贵州仁怀 564500）

酱香型大曲是由小麦为原料，经拌料、压制成型、入仓发酵和出仓贮存而成的糖化发酵剂[1-2]。酱香型大曲在开放式的环境生产，使得大曲网罗自然环境中丰富的微生物，而制曲过程中不同的发酵温度、贮存时间、贮存环境等因素，导致了大曲微生物的多样性和群落结构差异[3-6]。微生物在发酵过程中所发生一系列复杂的生化反应，从而产生了丰富的发酵基质、风味物质前体物质等，为酱香型白酒生产提供了风味物质前体和发酵所需酶系等[7-8]。因此，酱香型大曲是集菌系、酶系及物系为一体的重要载体，不同的品温控制策略等因素使成品曲的感官特性、理化指标和微生物群落组成各不相同[9]。

按照不同感官特性酱香型大曲分为黄曲、黑曲和白曲，三种大曲各有特点：黄曲皮厚，酱香浓郁，糖化力较低；黑曲皮薄，常带有糊味；白曲皮薄，酱香弱，但其糖化率高[10-11]。制曲环境和工艺等因素造就了大曲中的霉菌以红曲霉属Monascus、曲霉属Aspergillus、根霉属Rhizopus、犁头霉属Absidia、木霉属Trichoderma、青霉属Penicillium、横梗霉属Lichtheimia、拟青霉属Paecilomyces和毛霉属Mucor等为主[12-14]。霉菌可产生糖化酶、酯化酶等多种酶类[15]，能够分解曲块和酒醅中的淀粉[16]、蛋白质[17]、脂肪等[18]大分子物质为发酵微生物提供营养，且作为风味前体物质参与发酵，与大曲发酵特性密切相关。目前，鲜见可培养的大曲理化指标与霉菌群落的关联的报道，张云曌[19]经过对浓香型大曲微生物群落与理化性质的冗余分析，发现大曲的糖化力、水分与嗜热真菌属、嗜热子囊菌属、霉菌属、根霉菌属、毛霉属等呈负相关，液化力与嗜热真菌属、嗜热子囊菌属、毛霉属和根霉菌属呈正相关，与曲霉属呈负相关；酸度与曲霉菌属、根霉菌属、毛霉属呈正相关；但与嗜热真菌属和嗜热子囊菌属呈负相关。

解析大曲中的大曲理化指标与霉菌群落组成之间的关联对挖掘功能性微生物有至关重要的作用，有助于进一步掌握酱香型白酒酿造过程中的微生物信息。本研究基于传统可培养技术分离出不同感官特性酱香型大曲中霉菌，利用分子生物学鉴定所分离霉菌菌株，结合冗余分析探究了大曲理化指标与间霉菌群落的关联。为利用白酒酿造微生物资源奠定研究基础，为提高强化大曲的开发研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄曲YQ、黑曲BQ、白曲WQ 贵州省仁怀市某酱香型白酒厂拆仓曲，样品为2020 年11 月，该酒厂某一制曲车间中五个曲房中的拆仓曲（黑、白、黄曲）各一块，粉碎混合后用四分法进行缩分取样，备用；氢氧化钠 分析纯，天津大茂化学试剂厂；硫酸分析纯，川东化工集团；己酸、乙醇、乙酸 分析纯，上海沪试实验室器材股份有限公司；乙酸钠 分析纯，南京化学试剂股份有限公司；葡萄糖 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂 分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司；细菌真菌基因组提取试剂盒 北京天漠科技开发有限公司；2X Blastaq PCR Taq MasterMix 加拿大Applied Biological Materials 公司；QIAquick Gel Extraction Kit 德国QIAGEN 公司；DL2000 DNA Marker 日本Takara公司；LE Agarose 美国海晋生物公司。

FA1204N 电子天平 上海菁海仪器有限公司；DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱、HH-8J 数显恒温水浴锅 常州润华电器有限公司；DK-98-II 电炉天津市泰斯特仪器有限公司；YXQ-LS-100SII 立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯医疗股份有限公司；BCD-640WAGM 冷藏柜 青岛海尔股份有限公司；SW-CJ-2D 双人单面垂直送风净化工作台 上海乔跃电子有限公司；BSD-YX3200 立式智能精密摇床上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；SHP-250生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；5417R离心机 德国Eppendorf 公司；9700PCR 仪 美国应用生物系统公司；PowerPac HV 电泳仪 美国Biorad 公司；3730X 测序仪 美国应用生物系统公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同感观特性酱香型大曲理化指标分析 按照QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》[20]对三种不同感官特性酱香大曲的水分含量、酸度、液化力、糖化力、发酵力和酯化力进行测定。

1.2.2 不同感观特性酱香大曲中霉菌的分离、纯化与鉴定 称取10 g 经研磨的白曲、黄曲和黑曲样品于含数颗玻璃珠的90 mL 无菌水中，振荡30 min，并取原液1 mL 梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。分别取200 μL 稀释菌液涂布在PDA 培养基表面[21]。在30 ℃培养箱中培养2 d 后将菌株3～4 次点接种培养，获得纯的霉菌菌株。将纯化后的菌种接入试管斜面保存，置于4 ℃冰箱保藏备用[22]。

保藏的菌种送至成都罗宁生物科技有限公司，使用DNA 提取试剂盒提取分离纯化的霉菌DNA。采用真菌ITS 序列通用引物ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′）扩增霉菌的ITS 区域。PCR反应体系为50 μL，其中2XPCR Bestaq MasterMix 25 μL，超纯水18 μL，上游引物ITS1 2.5 μL，下游引物ITS4 2.5 μL，DNA 2 μL。PCR 扩增条件为：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30 个循环，72 ℃延伸1 min；4 ℃保温。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶150 V 电泳20 min 检测扩增条带，将回收的PCR 产物用ABI3730XL 进行测序[13]。

1.3 数据处理

大曲理化指标涉及有效的3 组平行检测数据平均值，结果使用（平均值±标准差）的形式表示，利用SPSS22.0 软件进行统计学分析处理，当P<0.05 时，不同大曲理化指标数据组之间被认为具有统计学的显著差异。基于美国国家生物信息技术中心数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）对原始霉菌序列进行BLAST 比对，使用MEGA7.0 软件中Neighbor-Joining 功能构建系统发育树，利用Excel 2019 绘制霉菌群落结构图，采用Canoco 5.0 软件[23]完成冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 结果与分析

2.1 不同感官特性酱香型大曲理化指标分析

大曲理化指标中的水分含量和酸度可在一定程度上表现出大曲质量，液化力、糖化力、酯化力则反映大曲中的酶系功能，而发酵力可反映大曲中某些微生物生长情况。不同感官特性酱香型大曲理化指标如表1 所示，其中水分含量从高到低依次为白曲12.89%，黑曲12.44%，黄曲11.63%，三种大曲水分均低于13%，代表大曲的水分含量适宜且成熟度较好。适宜的酸度可以抑制大曲中杂菌的生长[24]，酱香大曲酸度的范围为（1.0～3.5）×10-1mmol/g[20]，三种大曲酸度从高到低依次为黑曲3.16×10-1mmol/g，白曲2.64×10-1mmol/g，黄曲2.52×10-1mmol/g，均在适宜的酸度范围。发酵力从高到低依次为黄曲1.56 U，黑曲1.51 U，白曲1.46 U，液化力从高到低依次为黄曲1.23 U，白曲0.98 U，黑曲0.84 U，酯化力从高到低依次为黄曲22.63 U，黑曲22.48 U，白曲22.16 U，糖化力从高到低依次为白曲356.09 U，黄曲283.27 U，黑曲220.07 U。所测指标与张丽等[25]研究中贮存初期的酱香大曲理化指标基本吻合。三种酱香大曲的糖化力有显著性差异，该指标反映了大曲对淀粉的转化率，含量越高，转化率越高[26]。大曲的糖化力与微生物的生长繁殖有一定的相关性，特别是霉菌。酯化力和发酵力都作为大曲生化功能的动态指标，与大曲中微生物多样性及其代谢有密切联系。

表1 不同感官特性酱香型大曲理化指标Table 1 Physical and chemical indicators of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

2.2 不同感观特性酱香大曲中霉菌的分离、纯化与鉴定结果

从三种不同感官特性酱香型大曲中共分离纯化出霉菌78 株，其中白曲29 株，黄曲26 株，黑曲23株。将78 株霉菌菌株测序所得序列上传至NCBI获得的序列号，并在BLAST 进行序列比对，比对结果和大曲分离所得霉菌序列展示于表2。

表2 不同感官特性大曲菌株测序比对结果Table 2 Sequencing comparison results of Daqu strain with different sensory characteristics

为直观反映了所分离霉菌间亲源性和判断分离筛选出的霉菌菌株的种属，利用Neighbor-Joining 构建系统发育树，其具体分类地位见图1～图3 所示。其中33 株霉菌属于横梗霉属Lichtheimia：WQM-21、WQM-24、WQM-25 等13 株菌与MT982159.1Lichtheimia corymbifera同源性达100%，YQM-10、YQM-05、WQM-07、WQM-17、WQM-19 与MG772621.1Lichtheimia ornata同源性≥99%，YQM-12、YQM-21 与JN579140.1Lichtheimia hongkongensis同源性达100%，BQM-01、YQM-01、YQM-02 等13 株菌与MH453383.1Lichtheimia ramosa同源性≥99%。4 株属于青霉属Penicillium：WQM-09、WQM-32与MN197688.1Penicillium chrysogenum同源性达100%，WQM-03、WQM-27 与NG070021.1 缓慢产黄青霉Penicillium tardochrysogenum同源性≥99%。3 株属于曲霉属Aspergillus：BQM-20 与MT226558.1Aspergillus sydowii同源性达100%，BQM-23 与MH876710.1Aspergillus quadrilineatus同源性达100%，YQM-08 与NG069721.1Aspergillus intermedius同源性达99%。36 株属于拟青霉属Paecilomyces：BQM-09、BQM-10、WQM-02 等11 株 与MH874957.1Paecilomyces subglobosus同源性≥99%，BQM-02、BQM-03、BQM-04 等25 株与 ON853979.1Paecilomyces variotii同源性达100%。1 株附球菌属Epicoccum和1 株帚霉属Scopulariopsis：WQM-04 与 MN654935.1Epicoccum endophytica同源性达100%；BQM-18 与 EU-862178.1Scopulariopsis brevicaulis同源性达100%。

图1 白曲霉菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of mold in WQ

图2 黄曲霉菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of mold in YQ

图3 黑曲霉菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of mold in BQ

三种不同感官特性酱香型大曲的霉菌群落结构分析如图4 所示，共鉴定到6 个属13 种的霉菌78 株。白曲WQ 中霉菌为Paecilomyces subglobosus（31.03%）、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii（24.14%）、伞枝横梗霉Lichtheimia corymbifera（17.24%），Lichtheimia ornata（10.34%）、缓慢产黄青霉Penicillium tardochrysogenum（6.90%）、产黄青霉Penicillium chrysogenum（6.90%）、Epicoccum endophytica（3.45%）；YQ 中霉菌有分枝横梗霉Lichtheimia ramosa（46.15%）、伞枝横梗霉Lichtheimia corymbifera（26.92%）、宛氏拟青霉Paecilomyces variotii（7.69%）、Lichtheimia hongkongensis（7.69%）、Lichtheimia ornata（7.69%）、中间曲霉Aspergillus intermedius（3.85%）；BQ 中霉菌有宛氏拟青霉Paecilomyces variotii（69.57%）、Paecilomyces subglobosus（8.70%）、分枝横梗霉Lichtheimia ramosa（4.35%）、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis（4.35%）、伞枝横梗霉Lichtheimia corymbifera（4.35%）、聚多曲霉Aspergillus sydowii（4.35%）、四脊曲霉Aspergillus quadrilineatus（4.35%）。其中宛氏拟青霉Paecilomyces variotii和Lichtheimia corymbifera两种霉菌在三种大曲中均被鉴定出来，Lichtheimia ornata存在于白曲和黄曲中，Paecilomyces subglobosus存在于白曲和黑曲中，Lichtheimia ramosa存在于黄曲和黑曲中，中间曲霉Aspergillus intermedius和Lichtheimia hongkongensis仅在黄曲中鉴定出来，缓慢产黄青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica和Penicillium chrysogenum仅在白曲中鉴定出来，短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii和Aspergillus quadrilineatus仅在黑曲中鉴定出来。在三种大曲共有或特有的霉菌菌种中分枝横梗霉Lichtheimia ramosa和伞枝横梗霉Lichtheimia corymbifera在酒曲中具有很强的耐热性、生长能力，是产生蛋白酶、脂肪酶的主要菌种[27]，宛氏拟青霉Paecilomyces variotii大多在酱香型大曲中都有发现，耐热性很强，可以降解甲醇和糠醛类有害物质，解除对酵母菌的抑制作用，是重要的调节性霉菌[28]，黑曲和黄曲中鉴定到的曲霉属Aspergillus作为酿造过程中主要的供酶菌源，耐热性好，能产生糖化酶、蛋白酶、淀粉酶等活性较高的水解酶类[29-30]，已有多株高产酶的菌株从自然发酵体系中分离筛选出来，并被初步应用于强化白酒发酵过程[31-32]。

图4 三种不同感官特性大曲霉菌群落结构Fig.4 Mold community structure of Daqu with three different sensory characteristics

2.3 大曲理化性质和霉菌鉴定的相关性分析

采用RDA 冗余分析解析优势菌群与理化指标之间的相关性，其中两因素间的夹角为锐角时，表示存在正相关，反之为负相关，两因素投影到另一个因素的长度越长则相关性越大[33]。图5 冗余分析结果显示，实验数据霉菌与大曲理化指标总变异的98.43%能够被图中的变量所解释，第一排序轴能解释59.44%的变异信息，第二排序轴能解释38.99%的变异信息。液化力与酯化力、发酵力和糖化力都呈正相关，其中糖化力与Paecilomyces subglobosus、Lichtheimia corymbifera、缓慢产黄青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica、Lichtheimia ornata、Penicillium chrysogenum呈正相关，液化力与Lichtheimia ramosa、Lichtheimia corymbifera、中间曲霉Aspergillus intermedius、Lichtheimia ornata、Lichtheimia hongkongensis呈正相关，发酵力和酯化力与Lichtheimia ramosa、Aspergillus intermedius、Lichtheimia hongkongensis呈正相关，由此看出影响糖化力、酯化力、液化力和发酵力主要菌属为横梗霉属，研究表明横梗霉属与糖化酶系统的关键蛋白有关[34]；水分与酸度呈正相关，水分与宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、Paecilomyces subglobosus、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii、Aspergillus quadrilineatus、缓慢产黄青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica、Penicillium chrysogenum呈正相关；酸度与宛氏拟青霉Paecilomyces variotii、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii、Aspergillus quadrilineatus呈正相关，由此看出影响水分含量的主要是青霉属，影响酸度的主要为拟青霉属。

图5 霉菌与大曲理化指标之间的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis between mold and physical and chemical indicators of Daqu

3 结论

本研究以三种不同感官特性酱香型大曲研究对象，探究了黑、白、黄三种大曲理化指标和可培养霉菌群落之间的关联性。经测定三种大曲理化指标水分含量均低于13%，酸度均在（1.0～3.5）×10-1mmol/g范围内；发酵力和酯化力大小为黄曲>黑曲>白曲；液化力大小为黄曲>白曲>黑曲；糖化力大小为白曲>黄曲>黑曲。从三种不同感官特性酱香型大曲中分离78 株霉菌，经鉴定为6 个属13 种。在三种大曲中均鉴定出宛氏拟青霉Paecilomyces variotii和伞枝横梗霉Lichtheimia corymbifera，Lichtheimia ornata存在于白曲和黄曲中，Paecilomyces subglobosus存在于白曲和黑曲中，分枝横梗霉Lichtheimia ramosa存在于黄曲和黑曲中；黄曲中鉴定出的特有菌株为中间曲霉Aspergillus intermedius和Lichtheimia hongkongensis，白曲中鉴定出的特有菌株为缓慢产黄青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica和Penicillium chrysogenum，仅在黑曲中鉴定出的菌株为短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii和Aspergillus quadrilineatus。分析不同感官特性酱香型大曲霉菌群落结构与大曲理化指标之间的关系，结果表明，糖化力、液化力、酯化力和发酵力的主要菌属均为横梗霉属Lichtheimia。

本研究初步揭示了三种不同感官特性酱香型大曲理化指标和霉菌鉴定之间的关联性，进一步掌握了三种酱香型大曲中的霉菌生物信息，为进一步酱香大曲中功能性微生物的研究奠定基础，并为强化酱香大曲发酵性能提供数据支撑。