不同提取方法对井冈蜜柚皮精油组成与性质的影响

李 欣，华建新，罗杰洪，王国庆，陈 赣，周爱梅,

（1.华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性重点实验室，广东广州 510642；2.吉安井冈农业生物科技有限公司，江西吉安 343016）

柚子（Citrus maxima）为亚热带常绿乔木果树，芸香科柑橘原生柑橘亚科柚类[1-2]。柚皮是果蔬加工的副产物，而精油是柑橘皮中主要的脂溶性功能成分之一，存在于柑橘果皮的细小分泌腺中，其含量占果皮鲜重的0.5%～2%[3]，研究表明，柚皮精油具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、化痰止咳等功能[4]，在保健品开发、天然抑菌剂研制、新型药物制备等行业具有广阔的应用前景。江西省柑橘品种资源丰富，井冈蜜柚是江西省吉安市当地具有地理代表性的柚品种，品质极佳，种植规模不断扩大，具有良好的市场前景。但随着柚子加工工业的快速发展，形成了大量的柚皮副产物，而存在于井冈蜜柚皮中的精油（Jinggang pomelo peel essential oil，JPPEO）已被报道富含萜烯类、醛类等活性物质，利用价值颇高。

目前柚皮精油的提取方法有多种，主要有冷榨法[5]、有机溶剂萃取法[6]、超临界二氧化碳萃取法[7]和水蒸气蒸馏法[8]，这些方法各有优缺点[9]，其中水蒸气蒸馏法是最传统的方法，具有工艺简单、产量稳定、活性成分含量较高、成本低、无污染等优点，但是水蒸气蒸馏法由于提取温度较高、时间较长，会造成一系列问题，例如破坏热敏性成分、低沸点成分流失、不易蒸出高沸点成分、香气完整性受影响等等[10]。本课题组自主研发的先进技术——低温连续相变萃取技术具有操作方便、安全、环保、提取率较高、提取时间短、可使用食品级安全萃取溶剂且无溶剂残留等优势，是一种绿色高效的萃取技术[11]，目前已应用于沙姜油[12]、栀子油[13]、佛手精油[14]的萃取，但在柚皮精油提取方面的研究鲜见报道。

精油分析检测是研究精油功能活性，并对精油进行合理开发利用的重要工具和手段。精油的理化特性可以作为衡量其品质的重要参考，其中包括相对密度、折光指数、酸值、酯值、碘值等。而植物精油组成成分的分析方法主要包括中红外光谱法（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）[15]、高效液相色谱-质谱联用法（High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[16]、气相色谱-质谱联用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[17]、顶空气相色谱-离子迁移谱（Headspace-gas chromatography-ion migration chromatography，HS-GC-IMS）[18]几种方法。其中，GC-MS 是目前应用最为普遍的方法[19-20]，该技术具有灵敏度高、分离程度好、分析速度快等优点，但此技术无法分析鉴定出一些含量少而对风味至关重要的物质[21]。GC-IMS 是近年来新兴的一种分析方法，该技术具有样品无需前处理、灵敏度高、检测速度快等优点，目前已广泛应用于食品风味分析、品质检测等多个领域[22]。鲜见两种方法相结合应用于植物精油成分分析，因此本课题采用此两种方法进行井冈蜜柚皮精油成分分析，以期为井冈蜜柚皮精油的功能成分鉴定和品质鉴别提供新依据。

基于上述分析，本研究以井冈蜜柚子皮为原料，采用水蒸气蒸馏法、低温连续相变法两种不同方法制备JPPEO，并以精油得率为主要指标，通过单因素和正交试验确定低温连续相变法最佳提取工艺条件，并对两种提取工艺条件得到的JPPEO 的折光率、相对密度、酸值、酯值这些理化性质进行分析，进一步采用FT-IR、结合GC-MS 和HS-GC-IMS 分析JPPEO的组成，并运用PCA 统计分析方法对其进行组分差异分析，为更好地综合评价井冈蜜柚的质量，合理开发利用JPPEO 提供了一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

井冈蜜柚干皮 吉安井冈农业生物科技有限公司提供，采集于11 月份；无水硫酸钠 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；环己烷 天津富宇有限公司；环己酮（色谱纯）麦克林生物科技有限公司；C7～C40正构烷烃混标 美国O2Si 公司；正己烷（色谱纯）天津科密欧化学试剂有限公司。

水蒸气蒸馏简易装置 河南豫华仪器有限公司；低温连续相变萃取装置 珠海共同机械有限公司；Trace 1300 串联TSQ 8000 气相色谱-质谱联用仪（配有Xcalibur 软件）美国Thermo 公司；Flavour-Spec®Laboratory Analytical Viewer GC-IMS 联用仪（配有分析软件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GC X IMS Library Search）

德国G.A.S 公司；AL 104 万分之一电子天平 梅特勒一托利多仪器有限公司；Vertex 70 型傅里叶变换红外光谱仪、ATR 附件（ZnSe 晶面）德国布鲁克有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取井冈蜜柚皮精油 参考汤酿等[23]方法并加以改进。选取井冈蜜柚干皮 80 g，粉碎后与蒸馏水以料液比 1:12（g/mL）的比例混合，装入1 L 圆底烧瓶中，在160 ℃下加热至沸腾，从沸腾起计时提取5 h（直到无精油流出）后用正己烷萃取精油，经无水硫酸钠干燥后，再用氮吹仪除去残余正己烷，过0.22 μm 有机膜，得到柚皮精油，封装后置于-20 ℃备用。

1.2.2 低温连续相变提取井冈蜜柚皮精油的单因素实验 以井冈蜜柚精油得率为考察指标，对原料颗粒度、萃取压力、萃取温度、萃取时间、解析温度指标进行工艺优化。萃取溶剂为正丁烷，将按照原料堆密度0.3 kg/L 填入萃取釜。

1.2.2.1 原料颗粒度对井冈蜜柚精油得率的影响将井冈蜜柚干皮粉碎至20、30、40、50、60 目，在萃取温度50 ℃，萃取压力0.8 MPa，解析温度70 ℃，萃取时间70 min 条件下进行萃取，计算精油得率。

1.2.2.2 萃取压力对井冈蜜柚皮精油得率的影响将井冈蜜柚干皮粉碎至30 目，萃取压力分别设定为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 MPa，在萃取温度为50 ℃，解析温度70 ℃，萃取时间70 min 条件下进行萃取，计算精油得率。

1.2.2.3 萃取温度对井冈蜜柚皮精油得率的影响将井冈蜜柚干皮粉碎至30 目，设定萃取温度分别为40、45、50、55、60 ℃，在萃取压力0.7 MPa，解析温度70 ℃，萃取时间70 min 条件下进行萃取，计算精油得率。

1.2.2.4 萃取时间对井冈蜜柚皮精油得率的影响将井冈蜜柚干皮粉碎至30 目，设定萃取时间分别50、60、70、80、90 min，在萃取温度50 ℃，萃取压力0.7 MPa，解析温度70 ℃条件下进行萃取，计算精油得率。

1.2.2.5 解析温度对井冈蜜柚皮精油得率的影响将井冈蜜柚干皮粉碎至30 目，设定解析温度分别为60、65、70、75、80 ℃，在萃取温度50 ℃，萃取压力0.7 MPa，萃取时间60 min 条件下进行萃取，计算精油得率。

1.2.3 低温连续相变提取井冈蜜柚皮精油的正交试验 在单因素实验基础上，选取原料颗粒度为30 目，进一步对萃取温度、萃取时间、萃取压力及解析温度对井冈蜜柚皮精油得率的影响进行正交试验，试验设计因素水平表见表1。

表1 正交设计试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment design

精油得率按照下式进行计算，实验重复3 次。

式中：M1为精油的净质量，g；M2为柚皮的干重，g。

1.2.4 井冈蜜柚皮精油理化指标分析 在上述最佳的萃取工艺条件下，利用低温连续相变萃取设备获取井冈蜜柚皮精油，对其部分理化性质进行分析，并与水蒸气蒸馏提取所得精油进行对比。折光指数测定参考GB/T5527-2010《动植物油脂 折光指数的测定》；相对密度的测定参考GB/T 11540-2008《香料相对密度的测定》；酸值测定参考GB/T 14455.5-2008《香料 酸值或含酸量的测定》；酯值的测定参考GB/T 14455.6-2008《香料 酯值或含酯量的测定》。

1.2.5 FTIR 分析 将水蒸气蒸馏法提取的精油过0.22 μm 滤膜，连续相变法提取的精油不做处理。

1.2.5.1 仪器参数 分束器Beamsplitter Setting：KBr，检测器Detector Setting：RT-DLaTGS，波数范围3900～600 cm-1，扫描次数64，分辨率4 cm-1。

1.2.5.2 采样方法 设置采集条件，采集样品前采集背景，以空气为背景，采集红外光谱图。将精油均匀覆盖ATR 的晶体凹槽，每个样品用ATR 附件采集3 张谱图，经自动基线校正后，取平均光谱图作为样品红外光谱图，保存。

1.2.5.3 谱图分析 使用Omnic 9.0 软件（美国塞默尔世尔科技公司）进行红外光谱采集，存储，使用TQ Analyst 9.0 软件进行谱图处理及建模。

1.2.6 GC-MS 分析 参考汤酿等[23]方法，将20 μL 5 mg/mL 环己酮、200 μL 2mg/mL 井冈蜜柚皮精油溶于178 μL 色谱级正己烷中，过0.22 μm 有机膜，用于GC-MS 进样分析。

1.2.6.1 GC 条件 色谱柱：TG-5 MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：50 ℃保持2 min，然后10 ℃/min 升温至110 ℃，3 ℃/min 升至200 ℃，10 ℃/min 升至230 ℃保持5 min。载气（He）流速1.0 mL/min，进样量1.0 µL；分流比10:1。

1.2.6.2 MS 条件 质谱条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；四极杆150 ℃；母离子：50～550 m/z；溶剂延迟11.9 min。

1.2.6.3 挥发性物质定性和定量 应用软件内置的NISTMS Search 2.0 谱库对GC-MS 检测到的挥发性成分进行鉴定；取相似指数大于750 为有效数据，当相似指数大于750 则认定该组分存在于样品中；用环己酮作为内标物确定各种成分的含量；数据以平均值土标准差表示；将井冈蜜柚皮精油与正构烷烃（C7～C40）标准品进行GC-MS 分析。结合基峰、特征离子峰与文献报道的保留指数对比进行定性，保留指数计算公式为：

式中：RIx为待测组分的保留指数；Tx为化合物X 的保留时间，min，Z 和Z+1 分别为化合物X 出峰前后相邻正构烷烃标准品的碳原子数，Tz与Tz+1分别为Z 和Z+1 位碳原子对应正构烷烃的保留时间，min。

式中：Wi：挥发性物质含量（µg/mL），Ms：内标物质量（mg），Ai：挥发性物质峰面积，As：内标物的峰面积，M0：井冈蜜柚皮精油质量（mg）。

1.2.7 GC-IMS 分析条件

1.2.7.1 顶空进样条件 顶空孵化温度80 ℃；孵化时间10 min；孵化转速500 r/min；进样体积100 µL；进样针温度：85 ℃。

1.2.7.2 GC 条件 色谱柱：MXT-5 金属色谱柱（15 m×0.53 mm，1 µm）；色谱柱温60 ℃；载气为高纯N2（纯度≥99.999%）；载气流速程序：初始2 mL/min 保持2 min，在2～10 min 线性增至10 mL/min，在10～20 min 线性增至100 mL/min，在20～30 min 线性增至 150 mL/min 后保持10 min。

1.2.7.3 IMS 条件 离子源为氚源（6.5 keV）；正离子模式；漂移管长度9.8 cm；管内线性电压500 V/cm；漂移气流速150 mL/min（高纯氮气，纯度≥99.999%）；漂移管温度45 ℃[24]。

1.2.7.4 挥发性物质定性和定量 利用 GC-IMS 设备自带仪器分析软件（Laboratory Analytical Viewer（LAV）和插件（Reporter、Gallery Plot），以及 GC-IMS Library Search 定性分析软件）对精油的挥发性成分进行采集和分析。用峰面积归一化法确定各种成分的相对含量；同一精油样品的挥发性成分含量以三次结果的平均值±标准偏差（Mean values±SD）表示。

1.3 数据处理

以“平均值±标准差”的形式表示测定的理化参数值；选用 SPSS 25.0（美国IBM 公司）进行统计学处理，采用t检验进行三组间差异显著性分析，P<0.05，差异显著；采用独立样本t检验进行两组间差异显著性分析，在满足方差齐性的条件下，Sig.（双尾）<0.05，具有显著性；Dynamic PCA 插件进行动态PCA。

2 结果与分析

2.1 低温连续相变提取井冈蜜柚皮精油的单因素实验

2.1.1 原料颗粒度对井冈蜜柚皮精油得率的影响从图1 可知，井冈蜜柚皮原料颗粒度在20～30 目时，精油得率呈增大趋势（P<0.05）。当原料颗粒度达到30 目时，JPPEO 得率达到最大，为9.38‰。而随着目数不断增大，JPPEO 得率反而呈下降趋势（P<0.05）。这主要是因为原料颗粒越小，使得萃取溶剂与原料的接触面积越大，但目数过大时易堵塞滤网而影响JPPEO 的有效萃取，这与杨慧等[10]提取佛手精油的原料粒度一致。因此，最佳原料粒度为30 目。

图1 原料颗粒度对井冈蜜柚皮精油得率的影响Fig.1 Effect of particle size of raw materials on extraction rate of essential oil from JPPEO

2.1.2 萃取压力对井冈蜜柚皮精油得率的影响 萃取压力是改变低温连续相变溶剂对油脂溶解能力的重要参数[25]。从图2 可知，在萃取压力从 0.4 MPa升至 0.7 MPa 时，JPPEO 得率出现显著增大的趋势（P<0.05），在萃取压力为0.7 MPa 时，JPPEO 得率达到最大，达到9.9‰，随着压力升至0.8 MPa，JPPEO得率反而下降（P<0.05）。通过加大压力可以增大溶剂对油脂的溶解能力。但压力过大时，原料堆密度过大，导致萃取溶剂流速减小。因此，最佳萃取压力为0.7 MPa。

图2 萃取压力对井冈蜜柚皮精油提取率的影响Fig.2 Effect of extraction pressure on extraction rate of JPPEO

2.1.3 萃取温度对井冈蜜柚皮精油得率的影响 由图3 可知，当萃取温度从40 ℃升至50 ℃时，JPPEO得率出现显著增加趋势（P<0.05）。萃取温度为 50 ℃时，JPPEO 得率最高，达到10.15‰。而当萃取温度升至60 ℃时，得率开始下降（P<0.05）。温度升高，萃取溶剂扩散速率增加，更快地穿透JPPEO，但温度过高时，萃取溶剂正丁烷易汽化，其溶解量降低[26]，使JPPEO 得率降低。黄炜超[27]研究发现萃取温度在40～55 ℃之间，佛手精油的有效成分的相对百分含量呈上升趋势，温度过高导致易挥发成分损失。萃取温度为50 ℃时，井冈蜜柚皮精油的有效成分也避免被破坏。因此，最佳萃取温度为50 ℃。

图3 萃取温度对井冈蜜柚皮精油提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of JPPEO

2.1.4 萃取时间对井冈蜜柚皮精油得率的影响 从图4 可以知，随着萃取时间延长，井冈蜜柚精油得率不断上升（P<0.05），萃取时间为60 min 时，JPPEO得率达到9.05‰。随后随着萃取时间的延长，萃取精油得率反而显著下降（P<0.05）。精油在低温连续相变溶液体系中达到溶解平衡需要一定的时间，但体系一旦到达平衡后精油得率就不再上升，时间过长反而使精油的解析时间过长，致使低沸点成分部分流失[28]。所以，考虑到萃取时间过长会增加能耗和生产成本，JPPEO 低温连续相变的最佳萃取时间选取60 min。类似地，在黄炜超[27]佛手精油的研究中，在萃取时间为60 min 时有效成分相对百分含量达到最大值。此外，低温连续相变法提取JPPEO 最佳萃取时间仅为水蒸气蒸馏法（5 h）的五分之一，效率高。

图4 萃取时间对井冈蜜柚皮精油提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of JPPEO

2.1.5 解析温度对井冈蜜柚皮精油得率的影响 解析温度影响油脂和溶剂分离的速度。由图5 可知，解析温度从60 ℃升高至70 ℃时，JPPEO 得率不断显著升高（P<0.05），在解析温度为70 ℃时，JPPEO得率达到9.75‰，但当解析温度由70 ℃升至80 ℃，JPPEO 得率反而出现显著下降的趋势（P<0.05）。综上所述，低温连续相变法提取JPPEO 的最佳解析温度选取70 ℃。有研究表明解析温度较高会影响油脂品质且增加能耗，在解析速度得到保证和油脂得率影响不大的基础上，应选择较低的解析温度[26]。

图5 解析温度对井冈蜜柚皮精油提取率的影响Fig.5 Effect of analytical temperature on extraction rate of essential oil from JPPEO

2.2 低温连续相变提取井冈蜜柚皮精油的正交试验结果

2.2.1 低温连续相变提取JPPEO 的正交试验条件及结果 由表2 可得，各因素对JPPEO 提取率影响大小为：D>C>A>B，表明解析温度对低温连续相变萃取的JPPEO 得率影响最大，其次为萃取压力，萃取温度和萃取时间影响较小。由极差分析结果，各因素的最优水平组合为 A3B1C2D2，经过对这一组合进行3 次重复验证试验，精油提取率达到10.99‰，高于正交试验的最高组合A3B1C3D2（10.98‰）。所以各因素的最优水平组合A3B1C2D2，即原料颗粒30 目，萃取时间 60 min，解析温度70 ℃，萃取温度55 ℃，萃取压力0.6 MPa。

表2 L9（34）正交实验结果Table 2 Results obtained under the experimental conditions using the L9(34)orthogonal design

2.3 两种提取方法井冈蜜柚皮精油得率、理化性质对比

从表3 中可以看到，两种提取方法对JPPEO 的得率影响相差较大，其中低温连续相变法（10.99‰±0.58‰）相比于水蒸气蒸馏法（2.83‰±0.16‰）提取，得率高出了2.88 倍。

表3 井冈蜜柚皮精油部分理化性质Table 3 Some physicochemical properties of JPPEO

精油的理化特性是油脂品质评定指标之一，常表征的理化指标有相对密度、折光率、酸值、酯值、碘值。折光率和相对密度的大小均表示精油脂肪酸不饱和程度。而酸值代表的是脂肪中游离脂肪酸含量的多少，也是辨别脂肪质量的重要标准之一，油脂的酸值越小，说明油脂的质量越好，精炼度越好[29]。酯值是对精油中酯类化合物含量评定的一个指标，酯值越高代表油脂的酸败程度越严重。其值影响精油的风味。酯类成分能够给人一种厚重气息，使香气饱满沉重，但酯类成分过多，又容易形成油腻气息[30]，这也是低温连续相变法提取所得的JPPEO（L-JPPEO）较水蒸气蒸馏提取所得的JPPEO（H-JPPEO）的香味重的原因。在气味方面，L-JPPEO 在室温下为黄色至红棕色半固体膏状物，在低温下放置一段时间后会发生凝固现象，有少量蜡状沉淀物析出，具有柚子特有的浓郁香味，且无肉眼可见杂质，而H-JPPEO 为黄色澄清液体，具有新鲜蜜柚的特征香气，无可见杂质。

由表3 可得，L-JPPEO 比H-JPPEO 的相对密度和折光指数略高，这表明两种方法提取的精油成分相似，但L-JPPEO 中不饱和程度成分更多一些。从表3中还可以看到，H-JPPEO 的酸值和酯值均高于LJPPEO，这表明L-JPPEO 游离脂肪酸含量、酯类成分含量较少，L-JPPEO 质量更好。造成两者理化性质差异较大的原因是低温连续相变萃取装置密闭性较好，萃取温度较低，减少了原料与空气接触，抑制精油的氧化变质，使精油有较高的不饱和脂肪酸含量，较低的游离脂肪酸含量和酯类物质。

2.4 FTIR 分析

L-JPPEO 和H-JPPEO 的红外光谱图如图6 所示。参考朱为宏等[31]，由烯烃双键的特征吸收主要是C=C 伸缩振动、不饱和C–H 伸缩振动以及不饱和C–弯曲振动[32-33]可知，L-JPPEO 在3000～3100 cm-1处出现了=C–H 伸缩振动产生的吸收峰、在1620～1640 cm-1处出现了C=C 伸缩振动产生的吸收峰[34]和在790～840 cm-1范围内（797 cm-1）、885～895 cm-1范围内（886.02 cm-1）、985～995 cm-1范围内（988.95 cm-1）出现了=C 面外弯曲振动产生的吸收峰，而H-JPPEO 在1609.82 cm-1处出现了C=C–C=C 伸缩振动产生的吸收峰[35]以及在650～730 cm-1范围内（720.78 cm-1）、790～840 cm-1范围内（833.22 cm-1）、885～895 cm-1范围内（891.69 cm-1）出现了=C 面外弯曲振动产生的吸收峰，说明其物质成分中含有较多的烯烃双键，推断其可能为由异戊二烯构成的萜烯类物质。

图6 两种方法提取井冈蜜柚皮精油的红外光谱Fig.6 FTIR of JPPEO extracted by two methods

醇、酚分子中都存在羟基，氢键区的O–H 伸缩振动[14]和弯曲振动是这两类化合物的特征吸收峰，而第二个主要吸收峰为C–O 吸收峰[36]。由图6 中可知，L-JPPEO、H-JPPEO 分别在3358.16、3420.53 cm-1附近呈现一个宽的吸收峰，该峰为形成氢键缔合状态的 O-H，而且 L-JPPEO、H-JPPEO 均在1000～1250 cm-1处出现了C–O 的吸收峰且该吸收峰通常是谱图中最强吸收峰之一，L-JPPEO 在谱图中可能表现为1121 cm-1，由此推测L-JPPEO、HJPPEO 可能含醇类、酚类有机物。

此外，因L-JPPEO、H-JPPEO 在1580～1928 cm-1处存在羰基化合物红外光谱的特征强吸收带[27]，表明其中可能均含有含羰基化合物。又L-JPPEO 在1110.30 cm-1处存在脂肪酮的C–C 伸缩振动，进一步推断其可能含有酮类物质。同时，H-JPPEO 在1733.25 cm-1处存在酯类化合物中羰基的伸缩振动并在1030～1300 cm-1出现C–O–C 基团的不对称及对称收缩强吸收峰[37]，进一步推断其可能含有酯类物质。

本研究还发现，L-JPPEO、H-JPPEO 均在1725 cm-1左右出现醛基的特征吸收峰[38]，说明其可能含有醛类化合物；羧基（–COOH）的C=O 伸缩振动、O-H 的伸缩振动、O–H 的变形振动是识别羧基的主要系列峰[19]。L-JPPEO 在2835～3080 cm-1范围内产生高低不平的O–H 伸缩振动吸收峰，但没有在1710 cm-1附近产生缔合羧基的吸收或在1760 cm-1附近产生游离羧基的吸收、在920 cm-1产生O–H 的变形振动，因此，L-JPPEO 是否含有羧基有待进一步验证。综上所述，中红外光谱分析推测L-JPPEO 和H-JPPEO 含萜烯类化合物、醇类、酚类、醛类以及含羰基化合物，其中，L-JPPEO 含的羰基化合物可能为酮类物质，H-JPPEO 含的羰基化合物可能为酯类物质，但L-JPPEO 是否含有酸类以及两种方法提取的JPPEO 含有的其他有机物有待进一步验证。

2.5 GC-MS 分析

2.5.1 JPPEO 挥发性成分含量及种类的差异分析不同提取方法所得的JPPEO 挥发性成分总离子流图如图7 和图8，对GC-MS 所检测的成分进行NIST数据库匹配，同时采用内标法对各化合物含量进行计算，结果如表4 所示。

图7 低温连续相变提取所得井冈蜜柚皮精油GC-MS 总离子流图Fig.7 GC-MS total ion flow diagram of JPPEO obtained by low-temperature continuous phase transition

图8 水蒸气蒸馏法提取所得井冈蜜柚皮精油GC-MS 总离子流图Fig.8 GC-MS total ion flow diagram of JPPEO extracted by steam distillation

表4 GC-MS 鉴定不同提取方法井冈蜜柚皮精油的挥发性有机化合物Table 4 Identification of volatile organic compounds in JPPEO by GC-MS

从表4 可以看到，H-JPPEO 和L-JPPEO 中共检测出40 种挥发性有机物，其C 链均在C10～C20以内，包括萜烯类、醇类、酮类、醛类、酯类和酚类、醚类、苯类8 类化合物。从H-JPPEO 和L-JPPEO 精油样品中分别鉴定出23 和32 种挥发性有机物，HJPPEO 中检测出萜烯类15 种、醇类5 种、醛类1 种、酯类2 种。L-JPPEO 中检测出萜烯类15 种、醇类7 种、酮类3 种、醛类1 种、酯类2 种和酚类1 种、醚类1 种、苯类1 种。两种方法得到的精油主要成分相近，均为萜烯类物质。两种精油都检测出的有15 种，包括14 种萜烯类物质（α-侧柏烯、α-蒎烯、桧烯、β-月桂烯、β-蒎烯、水芹烯、罗勒烯、榄香烯、γ-榄香烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、石竹烯、（-）-Alpha-蒎烯、大牛儿烯D；5 种醇类（芳樟醇、马鞭草烯醇、4-萜烯醇、α-松油醇、（1R,5S）-rel-香芹醇）；1 种醛类物质（柠檬醛）。

GC-MS 结果表明，萜烯类化合物在L-JPPEO、H-JPPEO 中的含量分别为10、673.03 μg/mL，其中D-柠檬烯相对含量最高，分别占4.75、640.93 μg/mL，两种提取方法得到的精油中相同的萜烯类物质共9种，共有成分中 D-柠檬烯、β-月桂烯、β-蒎烯是其发挥药理作用的主要成分。其中，D-柠檬烯有类似柠檬的香气[39]。它的治疗作用已得到广泛研究，已有研究证明其具有抗炎[40]、抗菌[41]、抗氧化[42]、镇痛、抗癌[43]、抗糖尿病[44]、抗高脂血症[43]和胃保护作用[45]，以及其他有益健康的作用。β-月桂烯具有镇痛[46]、抗蚊虫[47]、止咳[39]作用。醇类物质相对含量仅次于萜烯类物质，在L-JPPEO 以及H-JPPEO 中的含量分别为7.32、3.17 μg/mL，其中相同成分有芳樟醇、马鞭草烯醇、4-萜烯醇、α-松油醇、（1R,5S）-rel-香芹醇。根据相关研究，桉叶油素具有消炎止痛的功效，其主要应用于止咳糖、人造薄荷中[48]。本研究发现桉叶油素在L-JPPEO 中占比较高，含量高达3.76 μg/mL，而在H-JPPEO 并未出现。在L-JPPEO 中检出而未在H-JPPEO 检出的酮类化合物有3 个，含量共为1.62 μg/mL，分别是香芹酮、右旋香芹酮、圆柚酮。其中香芹酮具有抗菌活性、抗氧化活性、抗肿瘤等活性已广泛被研究[49]；圆柚酮具有刺激的柚子香气，味苦，是柚子皮油和柚子果汁中重要的香味成分，在香精中具有増味增香的应用[50]。而两种提取法的JPPEO 中酯类、酚类含量较少。综上，低温连续相变法与水蒸气蒸馏法相比，提取的JPPEO 成分种类更多，提取出较多的醇、酮及热不稳定成分，更全面地反映井冈蜜柚皮中的化学成分，其原因是低温连续相变法以丁烷溶液为溶媒，对井冈蜜柚粉中弱极性以及非极性物质的渗透性和溶解能力显著提高，经过对物料进行多次低温浸提，避免了挥发性和不耐热化合物的损失和降解。

2.6 GC-IMS 分析

2.6.1 井冈山柚皮精油GC-IMS 谱图分析 采用GC-IMS 对不同提取方法JPPEO 挥发性有机物进行分析和鉴别。图9 表示JPPEO 的GC-IMS 三维谱图（保留时间、迁移时间和离子峰强度），从图中可以直观看出，两种提取方法的JPPEO 中的挥发性成分存在差异，为便于分析，采用俯视图进行差异对比，如图10 所示。图10（a）为JPPEO 的GC-IMS 二维谱图，纵坐标表示GC 分离挥发性物质时的运行时间（Measurement run，Mr），横坐标表示IMS 分离时挥发性物质相对于反应离子峰的漂移时间（Drift time，Dt）。整个图背景为蓝色，横坐标1.0 处红色竖线为反应离子峰（Reactive ion peak，RIP 峰，经归一化处理），反应离子峰右侧的每一个点代表一种挥发性物质，颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大，从图10（a）可以看出不同提取方法JPPEO 样品内挥发性有机物可通过GC-IMS 很好地分离。图10（b）为JPPEO 的GC-IMS 差异谱图，以L-JPPEO1 为参比，其余谱图扣除L-JPPEO1 中的信号峰，得到二者的差异谱图。标为（a）的蓝色区域说明该物质在此样品中较LJPPEO1 低，而标为（b）的红色区域说明该物质在此样品中较L-JPPEO1 高，从图10（b）中可以看到同一JPPEO 之间几乎没有差异，不同样品之前差异极为显著，其差异主要表现在离子峰的位置、数量、强度及时间上。若要进一步观察，需要转换成指纹图谱进行对比。

图9 不同提取方法井冈蜜柚皮精油的GC-IMS 三维谱图Fig.9 GC-IMS three-dimensional spectra of JPPEO extracted by different methods

图10 不同提取方法井冈蜜柚皮精油的GC-IMS 二维谱图Fig.10 GC-IMS two-dimensional spectra of JPPEO with different extraction methods

2.6.2 JPPEO 挥发性成分含量及种类的差异分析为进一步直观地观察不同提取方法JPPEO 的挥发性有机化合物的变化，根据JPPEO 挥发性物质气相色谱保留时间和离子迁移时间对挥发性组分进行定性分析，图11 为两种提取方法JPPEO 中挥发性成分特征峰位置点，每个特征峰对应1 种挥发性有机物质并整理至表5。通过GC-IMS 自带的Library Search软件进行组分分析，最终从两种提取方法的JPPEO样品中检测到挥发性成分72 种单体及部分化合物的二聚体，如表5 所示，71 种挥发性有机物C 链均在C2～C15以内，主要包括萜烯类18 种、醇类13种、醛类14 种、酮类8 种、酯类9 种、酸类3 种、其它6 种。两种提取方式的JPPEO 中挥发性化合物种类基本一致，但不同种类化合物所占比例略有区别。L-JPPEO 中萜烯类占45.75%，醇类占17.27%，醛类占3.80%，酮类占7.68%，酯类占15.85%，酸类占5.62%，其它类占4.04%，而H-JPPEO 中萜烯类占31.51%，醇类占32.78%，醛类占12.37%，酮类占5.83%，酯类占13.78%，酸类占0.96%，其它类占2.77%。

图11 两种提取方法井冈蜜柚皮精油中挥发性成分特征峰位置点Fig.11 Characteristic peak position of volatile components in JPPEO by two extraction methods

表5 GC-IMS 鉴定不同提取方法井冈蜜柚皮精油挥发性成分Table 5 Identification of volatile components of JPPEO with different extraction methods by GC-IMS

2.6.3 JPPEO 挥发性成分的指纹图谱 为进一步比较不同提取方法JPPEO VOCs 的差异，采用G.A.S.公司开发的 LAV 软件的Gallery Replot 插件，选取图中待分析区域自动生成指纹图谱，以识别不同提取方法JPPEO 的特征区域。如图12 所示，横轴为JPPEO 中的所有挥发性峰，纵轴为同一物质在不同提取方法JPPEO 中的信号峰强度。斑点范围从蓝色到红色，表明挥发性物质的含量从低到高。共识别出70 个信号峰，并用名称标记它们，而数字则代表未知物质。

图12 两种提取方法井冈蜜柚皮精油的挥发性有机物指纹图谱Fig.12 Finger print of volatile organic compounds in JPPEO by two extraction methods

从图12 可看出，红色框内A 区域的19 种化合物在L-FCEO（低温连续相比提取）中的相对含量较H-FCEO（水蒸气提取）高，包含丙酮醇、3-羟基-2-丁酮、二丙硫醚、γ-丁内酯、乙酸乙酯、丙酸、乙酸、2-甲基丁酸、3-戊酮、2-已烯醛、苯乙烯、萜品油烯、芳樟醇、2-乙酰基呋喃、乙酸苄酯、呋喃酮、（E,E）-异丙烯、（E）-罗勒烯、β-石竹烯；橙色框内B 区域的乙酸苯乙酯、三环烯、莰烯、4-萜烯醇、松油烯、松油烯、乙醇、β-蒎烯-D、β-蒎烯-M、α-蒎烯、E-罗勒烯、3-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯、月桂烯、γ-松油烯在两种精油样品中的含量相差不大；而绿色框内C 区域的各化合物在H-FCEO 中相对含量较高，包括正己醇、庚醛、2-庚酮、2-甲基吡嗪、2-已烯醛、呋喃酮、2,3-丁二醇、乳酸乙酯、异戊醇、丁酸甲酯、2,5-二甲基呋喃、2-乙基呋喃、2-甲基丁醛、3-甲基-2-丁醇、正丁醇、丁醛、2,3-丁二酮、乙酸甲酯、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、己酸乙酯、（E,E）-2,4-庚二烯醛、芳樟醇氧化物、香叶醇、水芹烯、3-异丙基-6-亚甲基-1-环己烯和戊醛27 种化合物。

2.6.4 JPPEO 中挥发性物质的PCA 根据精油中的挥发性成分信号峰对其进行主成分分析，使精油的特征差异可视化[51]。选取特征峰对应的峰强度值为特征参数变量，得到第一、二主成分图（图13），不同颜色的点代表不同提取方法JPPEO 样品的归类情况。如图13 所示，第一主成分（PC1）贡献率为98%，第二主成分（PC2）贡献率为1%，PC1 与PC2 的贡献率之和为99%，数据降维后所得综合变量在二维空间能很好地代表原始数据所反映的信息。通过二维空间的数据分布差异可以直观地观察到组间和组内样品间的差异性，组内各样品相对距离较近或重叠，说明不同提取方法精油样品的重复性较好，不同样品各组数据的成簇区域有明显的间距，说明不同提取方法精油样品间的特异性较明显，样品间VOCs 差异较大。且两种精油主要差异在PC1，组间距离明显，被很好地区分开。上述结果表明，JPPEO 中挥发性物质的PCA 分析可针对不同提取方法的JPPEO 进行快速分类鉴别，可用于比较不同提取方法的JPPEO品质，为井冈蜜柚精油的开发利用提供一定的参考。

图13 不同提取方法井冈蜜柚皮精油的挥发性PCA 分析Fig.13 Volatile PCA analysis of JPPEO with different extraction methods

3 结论

本研究结果表明，低温连续相变提取JPPEO 的最佳工艺为：颗粒度30 目，萃取温度55 ℃，萃取压力0.6 MPa，萃取时间60 min，解析温度70 ℃，此时精油得率为10.99‰。连续相变法提取的精油得率比水蒸气蒸馏法提取的精油得率高出了2.88 倍；精油理化性质实验结果表明低温连续相变萃取的井冈蜜柚皮精油的不饱和脂肪酸含量较高，游离脂肪酸含量较低，酯类成分含量较低，L-JPPEO 质量更好。中红外光谱技术鉴定L-JPPEO 和H-JPPEO 含萜烯类化合物、醇类、酚类、醛类以及含羰基化合物。GC-MS法从L-JPPEO 精油样品中鉴定出32 种有机物，萜烯类15 种、醇类7 种、酮类3 种、醛类1 种、酯类2 种和酚类1 种、醚类1 种、苯类1 种。而未从HJPPEO 精油样品中鉴定出酮类、酚类、醚类、苯类，其余成分种类基本一致，GC-MS 法仅从H-JPPEO鉴定出23 种挥发性有机物。GC-IMS 法结果表明两种提取方式的JPPEO 的化合物种类基本一致，从两种精油样品中鉴定出71 种共同有机物，但不同种类化合物所占比例略有区别，L-JPPEO 精油成分及占比分别为萜烯类（45.75%）、醇类（17.27%）、醛类（3.80 %）、酮类（7.68%）、酯类（15.85%）、酸类（5.62%）、其它类（4.04%），两种方法得到的精油主要成分相近，均为萜烯类物质，与水蒸气蒸馏相比，低温连续相变萃取技术提取出较多的酮类及酯类、酸类成分，更全面地反映井冈蜜柚皮中的化学成分。因此，低温连续相变萃取技术应用于井冈蜜柚皮精油生产，具有萃取温度和萃取压力低，萃取时间短，萃取温度萃取效率高，封闭性好，对精油成分无破坏等特点，展示出良好的经济效益及应用前景。