海藻酸钠-壳聚糖-茶末复合膜的制备及其对葡萄的保鲜效果

陈顺心，刘海波，朱静，徐楷博，徐亚强，陈龙，陈亚蓝

（信阳农林学院食品学院，河南信阳 464000）

随着食品行业的发展，人们要求食品更多地保证其天然性、绿色化。保鲜膜在食品保鲜中起到了非常重要的作用，可以有效阻止微生物的侵染，阻隔空气中的灰尘，延长食品保鲜期[1]。目前，市售保鲜膜材料以聚乙烯为主，存在降解速度慢、环境不友好等缺点。因此研制出可降解、生物安全、环境友好的成膜基材意义重大。

壳聚糖（chitosan，CS）及其衍生物[2-5]、海藻酸钠（sodium alginate，SA）[6-9]具有成膜性好、安全性高等特点，但单独使用存在膜液流动性差、韧性差等问题。研究表明，将成膜基材共混复合并添加功能性成分如茶多酚、茶多糖等[10-13]，可以使膜的机械性能、理化性能、阻隔性能等得到改善。茶叶中茶多酚具有较强的抗氧化作用，可与多糖、蛋白等以共价键和非共价键结合，使其抗氧化作用增强[14-17]。晏晶等[18]利用茶多酚-壳聚糖复合膜对红葡萄进行保鲜，贮藏期显著延长。郝子娜等[19]制作出茶多酚-海藻酸钠可食复合涂膜对草鱼进行保鲜，有效地抑制了鱼肉的劣变，保鲜效果良好。

因此，为提高茶多酚复合膜的保鲜能力，使其得到广泛应用，本研究采用绿茶茶末、食品级壳聚糖及海藻酸钠制备可食性保鲜膜，运用单因素及正交试验确定海藻酸钠-壳聚糖-茶末复合膜的最佳配比，并对所制备的膜进行保鲜应用，旨在为茶末废弃物的综合利用和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

信阳毛尖废弃茶末：河南省信阳市老岗茶园；新鲜带蒂葡萄：市售。

1.2 主要试剂和设备

壳聚糖、海藻酸钠（食品级）：郑州亿之源化工产品有限公司；丙三醇、冰乙酸、无水氯化钙：天津市大茂化学试剂厂；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；钼酸铵：天津市北辰区方正试剂厂；草酸：天津市化学试剂三厂；乙二胺四乙酸二钠：天津市致远化学试剂有限公司；硫酸：开封市芳晶化学试剂有限公司；硝酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；邻苯二酚、柠檬酸、偏磷酸：国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：郑州派尼化学试剂厂；愈创木酚：天津市登峰化学试剂厂；过氧化氢：汕头市茂城利发化工有限公司。以上试剂除特殊说明外，均为分析纯试剂。

DZKW-0-2 电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；A390 紫外可见分光光度：翱艺仪器（上海）有限公司；TG16 高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；WYT 型糖度计：成都豪创光电仪器有限公司；CP214 电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；JC101-2A 电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；SHP 生化培养箱：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；TMS-PRO 质构仪：北京盈盛恒泰科技有限责任公司；LDZM-80L-Ⅲ立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；WYA-2S 手持折光仪：上海申光仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 SA-CS-茶末复合膜的制备

复合膜的制备参照兰文婷等[8]的方法，并略作修改，工艺流程见图1。

图1 SA-CS-茶末复合膜的制备Fig.1 Preparation of SA-CS-tea powder composite membrane

1.3.2 单因素和正交试验设计

以复合膜的水分含量、DPPH 自由基清除率、抑菌圈直径、厚度和抗拉伸强度为指标，选择茶末添加量、壳聚糖添加量、海藻酸钠添加量进行单因素试验，设置茶末添加量为0、0.5%、1.0%、1.5% 和2.0%；壳聚糖添加量为0.12%、0.20%、0.32%、0.48% 和0.60%；海藻酸钠添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。

在单因素试验基础上，进行L9（34）正交试验，确定SA-CS-茶末复合膜最佳添加量，因素水平设计见表1，由于单因素试验中海藻酸钠添加量采用0.5%间隔进行试验，结果不显著（p＞0.05），因此正交试验间隔添加量设置为1.0%。

表1 L9（34）正交试验因素水平设计Table 1 L9（34）factors and levels of the orthogonal test

1.4 SA-CS-茶末复合膜性质测定

1.4.1 复合膜厚度测定

将SA-CS-茶末复合膜对折4 次即16 层，用精度为0.02 mm 的游标卡尺取3 个不同位置点测定，平均值为膜的厚度（mm）。

1.4.2 复合膜水分含量的测定

将复合膜剪成20 mm×20 mm 的正方形，称其质量记为M1（g），然后将其置于称量瓶中称质量记为M2（g），在105 ℃鼓风干燥至恒重，于干燥器中冷却至室温，称质量记为M3（g）[17]，水分含量（h，%）计算公式如下。

1.4.3 复合膜机械性能的测定

采用质构仪测量膜的抗拉强度，复合膜的大小为10 mm×50 mm，探头测试条件：测试速度60 mm/min，起始力为0.1 N，拉伸距离为40 mm，抗拉伸强度σ（MPa）计算公式如下。

式中：p为最大负荷、断裂负荷、屈服负荷，N；b为试样宽度，mm；d为试样厚度，mm。

1.4.4 复合膜抗氧化的测定

参考汲雪宁[13]的方法测定DPPH 自由基清除率。准确称取3.94 mg DPPH 试剂于棕色容量瓶中用无水乙醇定容至50 mL，混合均匀，得到浓度为0.2 mmol/L DPPH 储备液，置于4 ℃冰箱备用。

准确称量复合膜12.50 mg 放入烧杯中，加10 mL水，90 ℃水浴加热30 min 溶解复合膜，冷却至常温，转移到25 mL 的容量瓶中，定容、摇匀，静置30 min。取2 mL 上清液加入2 mL DPPH 溶液，测定其吸光度记为Ai，取2 mL 上清液和2 mL 无水乙醇测定其吸光度记为Aj，取2 mL 蒸馏水加入2 mL DPPH 储备液测定其吸光度记为A0，分别重复3 次，DPPH 自由基清除率（X，%）计算公式如下。

1.4.5 复合膜抑菌性的测定

参照陈桂芸等[5]的方法测定复合膜抑菌性。以黑曲霉为指示菌，采用双层平板法测定复合膜溶液对黑曲霉的抑制作用。先倒入15 mL PDA，凝固后再倒入15 mL PDA，涂布0.46×106CFU/mL 的孢子液500 μL，待完全吸收后打孔（9 mm），加入500 μL 1.3.1 方法中制备的膜液，37 ℃培养48 h，测定抑菌圈直径（mm），以无菌蒸馏水为空白对照[3]。

1.5 葡萄新鲜度表征

1.5.1 保鲜试验预处理

准备4 个储藏瓶，放入121 ℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌15 min，冷却至室温后再放入50 ℃烘箱中烘干备用。挑选成熟度、色度、大小一致的健康带蒂葡萄，用剪刀减去果蒂后分别在4 个储藏瓶中放入20 颗葡萄，记录质量（g）。将储藏瓶按储藏条件分为4 组：1）敞口；2）保鲜膜（厚度100 μm，耐热温度110 ℃）；3）封口膜（厚度127 μm，耐热温度100 ℃）；4）复合膜。其中后3 组再用封口膜包裹膜及瓶口，保证封闭状态，在室温下储藏0～16 d，每隔4 d 测定失重率、可溶性固形物含量等指标。

1.5.2 失重率

参考刘晨霞等[20]的方法，按照如下公式计算失重率（S，%），计算公式如下。

式中：A1为贮存前葡萄质量，g；A2为贮存后葡萄质量，g。

1.5.3 果实中可溶性固形物含量测定

可溶性固形物含量采用手持折光仪进行测量，随机取3 个葡萄为1 组，取平均值。

1.5.4 腐烂率

参考张婷渟等[21]的方法计算葡萄腐烂率（F，%），葡萄上出现斑点，菌丝均判定为腐烂果实。

F=M/N× 100

式中：M为腐烂的果粒；N为总果粒。

1.5.6 葡萄中VC含量的测定

参考李军[22]的钼蓝比色法测定VC含量。

1.5.7 多酚氧化酶和过氧化物酶活性测定

参考黄赫雁等[23]和李忠光等[24]的方法进行多酚氧化酶和过氧化物酶活性测定。

1.6 数据处理

所有试验设置3 个平行，结果以平均值±标准差表示。使用Excel 2019 分析数据及制图、SPSS 分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 茶末添加量

茶末添加量对复合膜性能的影响见表2。

表2 茶末添加量对复合膜性能的影响Table 2 Effect of tea powder concentration on property of composite membrane

由表2 可知，不同茶末添加量制得的复合膜水分含量均低于40%。复合膜具有一定吸水性，当复合膜水分含量超过一定水分含量，有利于微生物的生长繁殖，失去保鲜特性；低水分含量能抑制食品的化学变化和微生物生长繁殖。40%以下水分含量不利于绝大多数微生物的生长[25-26]。

茶末中富含茶多糖、茶多酚等功能成分，对复合膜DPPH 自由基清除率有一定影响。不同茶末添加量制得的复合膜DPPH 自由基清除率随茶末添加量的增加先上升后趋于平稳。当茶末添加量大于1.0% 时DPPH 自由基清除率无显著性变化。

随着茶末添加量的增加，复合膜的抑菌圈直径先增加后趋于平稳。当茶末添加量超过1.0%时，复合膜的抑菌圈直径变化趋于平稳。

随着茶末添加量的增加，复合膜厚度和抗拉伸强度均呈增加趋势，当茶末的添加量超过1.0%时，各指标增幅趋于稳定。

综上所述，综合考虑经济成本，SA-CS-茶末复合膜较为适宜茶末添加量为1.0%，因此选择茶末添加量0.5%、1.0%、1.5%进行正交优化试验。

2.1.2 海藻酸钠添加量

海藻酸钠添加量对复合膜性能的影响见表3。

表3 海藻酸钠添加量对复合膜性能的影响Table 3 Effect of sodium alginate concentration on property of composite membrane

由表3 可知，随着海藻酸钠添加量增加，水分含量呈下降趋势且均低于40%，不利于绝大多数微生物的生长；DPPH 自由基清除率基本不变，无显著性差异；海藻酸钠添加量为0.5%～1.0% 时，其机械性能较差。因此，选取海藻酸钠添加量的最佳范围为1.5%～2.5%；复合膜的抑菌圈直径随着海藻酸钠添加量增加逐渐增大，海藻酸钠添加量2.0% 和2.5% 抑菌圈直径较大，分别为15.32 mm 和16.71 mm，结合厚度、机械性能和水分含量的结果，海藻酸钠最佳添加量为2.0%。

综上所述，SA-CS-茶末复合膜较为适宜海藻酸钠添加量为2.0%，因此选择海藻酸钠添加量1.0%、2.0%、3.0%进行正交优化试验。

2.1.3 壳聚糖添加量

壳聚糖添加量对复合膜性能的影响见表4。

表4 壳聚糖添加量对复合膜性能的影响Table 4 Effect of chitosan concentration on property of composite membrane

由表4 可知，随着壳聚糖添加量增加，水分含量呈下降趋势且均低于40%，不利于绝大多数微生物的生长。当壳聚糖添加量为0.12%～0.20%时，其机械性能较差，壳聚糖添加量大于0.32%时，机械性能提升且趋于稳定。结合经济效益，壳聚糖最佳添加量为0.32%。通过差异性分析可知，壳聚糖添加量对DPPH 自由基清除率无较大影响。当壳聚糖添加量大于等于0.32%时，复合膜抑菌圈直径无明显变化，因此，壳聚糖最佳添加量为0.32%。当壳聚糖浓大于0.32% 时，复合膜的抗拉伸强度无显著性变化，但壳聚糖添加量为0.32% 时，抑菌效果较好，因此壳聚糖最佳添加量为0.32%。综上所述，选择壳聚糖添加量为0.22%、0.32%、0.42%进行正交优化试验。

2.2 SA-CS-茶末复合膜正交试验结果

2.2.1 DPPH 自由基清除率的正交试验

不同因素添加量对复合膜DPPH 自由基清除率的正交试验结果见表5。

由表5 可知，各因素对SA-CS-茶末复合膜DPPH自由基清除率的影响程度依次为C＞A＞B，即茶末添加量影响最大，其次为海藻酸钠添加量，壳聚糖添加量影响最小。正交试验中，DPPH 自由基清除率最强的为A2B1C2（96.56%）。由于正交试验优化得出的最优组合为A1B1C3，故需进行验证试验。通过验证，A1B1C3组合制得的SA-CS-茶末复合膜DPPH 自由基清除率为96.24%，低于正交9 组试验中最优结果，因此SA-CS-茶末复合膜对DPPH 自由基清除率最佳的工艺条件为A2B1C2。

2.2.2 复合膜厚度的正交试验

不同因素添加量对复合膜厚度的正交试验结果见表6。

表6 复合膜厚度的正交试验结果Table 6 Orthogonal test of thickness of composite membrane

当壳聚糖和海藻酸钠添加量分别为0.22% 和1.0% 时制备的薄膜，膜成型效果较差，容易断裂。随着复合膜厚度增加，膜的机械性能、抗氧化性能和抑菌性均有所增加。所以，最大选择膜厚度为最佳结果。由表6 可知，各因素对SA-CS-茶末复合膜厚度的影响程度依次为A＞C＞B，海藻酸钠添加量影响最大，其次为茶末添加量，壳聚糖添加量影响最小。正交试验中，复合膜厚度最大的为A3B1C3（0.066 mm）。正交试验优化得出的最优组合为A3B2C3与A3B1C3结果不同，故需进行验证试验。通过验证，A3B2C3组合制得的SA-CS-茶末复合膜的厚度为0.070 mm，优于正交试验中A3B1C3，因此制作SA-CS-茶末复合膜过程中厚度最佳的工艺条件为A3B2C3。

2.2.3 复合膜抗拉伸强度的正交试验

不同因素添加量对复合膜抗拉伸强度的正交试验结果见表7。

表7 复合膜抗拉伸强度的正交试验结果Table 7 Orthogonal test of tensile strength of composite membrane

由表7 可知，各因素对SA-CS-茶末复合膜抗拉伸强度的影响程度依次为C＞A＞B，茶末添加量影响最大，其次为海藻酸钠添加量，壳聚糖添加量影响最小。正交试验中，复合膜抗拉伸强度最大的组合为为A3B1C3（4.90 MPa），正交试验优化得出的最优组合也为A3B1C3，试验结果相同，因此制作SA-CS-茶末复合膜过程中抗拉伸强度最佳的工艺条件为A3B1C3。

2.2.4 复合膜抑菌性的正交试验

不同因素添加量对复合膜抑菌性的正交试验结果见表8。

表8 复合膜抑菌性的正交试验数据Table 8 Orthogonal test of bacteriostatic activity of composite membrane

由表8 可知，各因素对SA-CS-茶末复合膜抑菌性的影响程度依次为A＞C＞B，海藻酸钠添加量影响最大。正交试验中，复合膜抑菌性最好的为A2B2C3（19.1 mm）。由于正交试验优化得出的最优组合为A2B3C3，故需进行验证试验。通过验证，A2B3C3组合制得的SA-CS-茶末复合膜的抑菌圈直径为18.3 mm，低于A2B2C3试验结果，因此抑菌效果最佳的工艺条件为A2B2C3。

2.2.5 正交试验综合分析

由于不同指标对应的最优参数组合不一致，需要进行综合平衡[27]，结果如表9所示。

表9 综合平衡结果Table 9 Integrated balance results

从表9 可以看出，海藻酸钠添加量对复合膜厚度和抗拉伸强度以A3水平为最好，对DPPH 自由基清除率和抑菌性以A2水平为最好。其中复合膜厚度主要影响制膜效果、抗拉伸强度、抗氧化能力和抑菌性能，在DPPH 自由基清除率和抑菌性较好的基础上，抗拉伸强度的极差又不是影响最大的因素，因此，海藻酸钠添加量以A2水平（2.0%）为较优配方；壳聚糖添加量对复合膜DPPH 自由基清除率和抗拉伸强度以B1水平最好，对厚度和抑菌性以B2水平最好，但壳聚糖各指标的极差都最小，表明壳聚糖添加量是影响最小的因素，因此，壳聚糖添加量以B1水平（0.22%）为较优配方，且具有较好的经济效益；茶末添加量对厚度、抗拉伸强度、抑菌性以C3水平最好，对DPPH 自由基清除率以C2水平最好，但C3水平在正交试验中高于C2水平，且二者相差结果不大。因此，茶末添加量取C3（1.5%）水平最好。

因此，最佳的试验方案是A2B1C3，即海藻酸钠、壳聚糖、茶末的添加量分别为2.0%、0.22% 和1.5%。其DPPH 自由基清除率为96.44%，厚度为0.041 mm，抗拉伸强度为1.9 MPa，抑菌圈直径为18.6 mm。

2.3 复合膜保鲜效果的影响

2.3.1 果实失重率

果实失重率见图2。

图2 果实失重率Fig.2 Weight loss of the fruit

由图2 可知，室温保存16 d 时，SA-CS-茶末复合膜处理组的失重率比未覆膜组低1.26%，但高于保鲜膜（3.49%）和封口膜（2.58%）处理组，表明复合膜处理能够降低果实的失重率，但与保鲜膜处理组和封口膜处理组相比效果还不理想，原因是复合膜有一定的透气性，水蒸气蒸发散失，而保鲜膜、封口膜不透气，水蒸气无法溢出，因此失重率低。

2.3.2 果实腐烂率

葡萄腐烂率如图3所示。

图3 果实腐烂率Fig.3 Rotting of the fruit

由图3 可知，葡萄室温保存16 d，复合膜组的腐烂率为23%，未覆膜、保鲜膜和封口膜组的腐烂率分别57%、37%和70%，封口膜组腐烂率较高是由于气密性好，瓶内水蒸气含量较高，导致大量霉菌生长。复合膜的失重率虽然比封口膜组、保鲜膜组的高，但是透气性较好，且抑制了霉菌的生长，所以腐烂率比较低，因此复合膜可以更好的保鲜葡萄，降低葡萄被微生物感染的概率。

2.3.3 果实中可溶性固形物

果实在储藏期间淀粉等物质会分解为小分子糖，使果实的糖度增加[20]。葡萄可溶性固形物变化如图4所示。

图4 果实可溶性固形物含量Fig.4 Sugar content of the fruit

由图4 可知，随着贮藏时间的延长，可溶性固形物含量增加，但复合膜处理组的可溶性固形物含量低于未覆膜、保鲜膜和封口膜处理组，表明复合膜处理组能够有效抑制果实贮藏期间的生理活动。

2.3.4 果实中VC含量

果实VC含量如图5所示。

图5 果实VC 含量Fig.5 VC content of the fruit

VC在葡萄贮藏过程中会逐渐氧化分解，导致VC含量下降。由图5 可知，随着贮藏时间的延长，VC含量逐渐减少，贮藏4 d，未覆膜、保鲜膜、封口膜和复合膜组的VC含量分别为5.8、6.1、6.2 mg/100 g 和6.7 mg/100 g，贮藏4 d 后各组的VC含量下降速率增大，贮藏16 d，复合膜组的VC含量高于其他处理组，表明复合膜能够有效的抑制葡萄中VC的分解。

2.3.5 果实中多酚氧化酶活性

果实多酚氧化酶活性见图6。

图6 果实多酚氧化酶活性Fig.6 Activity of polyphenol oxidase of the fruit

由图6 所知，随着贮藏时间的延长，葡萄果实中的多酚氧化酶活性整体呈现先增大后减小趋势。果实贮藏至12 d，未覆膜组的多酚氧化酶活性增加了62%，保鲜膜处理组增加了59%，封口膜处理组上升了38%，而复合膜组上升了22%，贮藏16 d，复合膜组多酚氧化酶活性低于其他处理组，说明复合膜处理有效抑制了葡萄多酚氧化酶活性，延缓了葡萄的褐变。

2.3.6 果实中过氧化物酶活性

果实过氧化物酶活性见图7。

图7 果实过氧化物酶活性Fig.7 Activity of peroxidase of the fruit

由图7 可知，贮藏前4 d 各组的过氧化物酶活性均呈上升趋势；贮藏4～8 d，未覆膜组过氧化物酶活性下降，其余3 组均上升；贮藏8～16 d，各组过氧化物酶活性均开始下降。整个贮藏过程中复合膜组的过氧化物酶活性始终比其他组的活性高，说明复合膜处理能够有效维持葡萄中过氧化物酶的活性，使葡萄贮藏时间更长。

3 结论

通过单因素试验和正交试验确定SA-CS-茶末复合膜最佳制备工艺为海藻酸钠添加量2.0%、壳聚糖添加量0.22%、茶末添加量1.5%，此条件下制得的复合膜DPPH 自由基清除率为96.44%，厚度为0.041 mm，抗拉伸强度为1.9 MPa，抑菌圈直径为18.6 mm。此工艺制备复合膜具有较好的抗氧化、抑菌特性，有一定的韧性。与未覆膜组、保鲜膜组、封口膜组相比，SA-CS-茶末复合膜能够有效降低葡萄的腐烂率、抑制VC含量下降、延缓可溶性固形物含量上升，并有效地抑制了多酚氧化酶活性，延缓果实褐变，提高了果实过氧化物酶活性，延缓果实衰老。因此，认为SA-CS-茶末复合膜在一定程度上对葡萄具有保鲜效果。