基于肠道菌群调节研究桂枝加葛根汤治疗颈型颈椎病家兔作用机制

秦宇航

南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院，江苏 南京 210023

颈型颈椎病（NTCS）是颈椎病的初期形态，为其他各型颈椎病早期的共同表现，以颈肩疼痛为主症。此病极为常见，约占颈椎病总发病率65.52%，影响范围广且呈低龄化趋势[1]。《伤寒论》桂枝加葛根汤由于善愈颈项强痛诸症，被临床广泛用于治疗NTCS 并取得了公认效果。既往文献多从活血化瘀和疏经通络等方面对桂枝加葛根汤治疗NTCS 的机制加以阐述[2]，笔者经研究发现，NTCS 之产生实与脾胃功能联系密切，桂枝加葛根汤可能通过调节肠道菌群（IF）而实现对NTCS 的治疗作用。本研究基于IF调节探讨桂枝加葛根汤治疗NTCS 家兔的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级6 月龄家兔[家兔购自南京中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（苏）2018-0049]9 只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg。按清洁级的要求饲养，自由进食。本实验经由南京中医药大学动物伦理委员会审核并批准（审批号：20211116）。

1.2 主要药品桂枝加葛根汤药液（葛根12 g，桂枝、生白芍、生姜各9 g，红枣12 枚，炙甘草6 g，按此剂量比例准备药材，用纯净水浸泡1 h，武火煮沸药汤后，继续文火煎煮30 min，去除药渣，制成含生药1 g/mL 的浓缩液，在4 ℃环境下保存备用），15%番泻叶水煎液（桂枝加葛根汤药液及番泻叶水煎液均由南京仙林医院药房提供）。

3%戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号：AM00469）、4%多聚甲醛（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：CR2209049）；粪便DNA 提取试剂盒（天根：DP328-02）、Hieff NGS Ultima Pro DNA Library Prep Kit 全能型DNA 建库试剂盒（YEASEN：2197ES96） 、 Hieff NGS Tagment Index Kit for Illumina（YEASEN： 12416ES97）； 血管活性肠肽（VIP）、神经肽Y（NPY）、脂多糖（LPS）的酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（规格：48T）及其相应抗体。以上试剂及药品均由江苏安蒂默生物科技有限公司提供。

1.3 主要器材离心机（Eppendorf）、酶标仪（Biotek ELX800）、超低温冰箱（Eppendorf）、电泳仪（北京六一）、便携式X 射线成像仪（平生医疗科技有限公司）。

1.4 分组将全部家兔以体质量编号，再按随机数字表法随机分成空白组、模型组、桂枝加葛根汤组（中药组），共3 组，每组各3 只。空白组不造模，其余2 组均制成脾虚证NTCS 家兔模型。

1.5 动物模型建立

1.5.1 脾虚证家兔模型经适应性喂养1 周后，参考文献[3]，每隔1 d 予以模型家兔15%番泻叶水煎液，按20 mL/kg 体质量灌胃，共14 次，持续28 d，即可形成家兔脾虚证模型。

1.5.2 NTCS 家兔模型以低头位寒湿刺激法[4]建立NTCS 家兔模型，具体操作方法如下：用剪毛器剔去家兔颈部毛发，置于自制家兔固定盒中，通过兔盒的卡槽式设计，使家兔维持低头屈曲45°位，后颈部肌肉呈牵拉状态，并敷以冰袋。固定完毕后，将吹风机调至5 级给予兔颈部冷风刺激。每次2 h，每天2 次，共4 h，造模周期为28 d。每次造模松解后置家兔于相应笼中自由饲养，正常饮食。

NTCS 造模与脾虚证造模同时进行，同时结束。造模结束后第1 天进行模型评估：①模型家兔颈后肌肉组织出现痉挛、僵硬，或有明显条索状物触及。②以便携式X 射线成像仪对模型家兔进行颈椎正侧位摄片检查，显示有颈椎曲度变直、椎体缘增生或椎间隙狭窄改变。③模型家兔出现精神倦怠、饮食减少、拱背、大便稀溏、肛周污秽等表现。同时满足上述3 项标准者，可认为造模成功，不合格者予以剔除。

1.6 给药方法从确认所有家兔造模成功后第1 天开始，每天给药1 次，连续给药7 d。①空白组和模型组不予给药，任其自主发展。②根据人兔给药换算公式计算，中药组以桂枝加葛根汤药液按10 mL/kg灌胃。

1.7 观察指标与检测方法于给药结束后处死全部动物，进行指标检测。

1.7.1 IF 的16SrRNA 基因高通量测序分析采集待测家兔新鲜的粪便样品，置于灭菌的Eppendorf 管中，放置于-80 ℃冰箱保存。分别检测家兔粪便中IF的种类和丰度，操作如下：以DNA 提取试剂盒提取家兔粪便样本DNA。然后使用相应引物对16SrRNA V3-V4 特异性基因片段区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。PCR 扩增条件：98 ℃预变性1 min；随后98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计扩增30 个循环；最后72 ℃延伸5 min。继之使用1.8%琼脂糖凝胶对PCR 产物片段进行筛选，检测合格的产物在Illumina Hiseq 平台上进行文库构建及基因测序。然后利用相关软件对原始数据进行拼接、过滤、聚类和比对，从而获得菌群丰度差异。

1.7.2 直肠、迷走神经、下丘脑和颈交感干中各神经肽检测①维持家兔麻醉状态，在冰台上立即展开无菌解剖。于距肛门0.5 cm 处切取直肠1 cm；于左颈动脉鞘内切取迷走神经及颈交感神经各1 cm；继以咬骨钳夹出C3～5椎间盘组织；开颅切取下丘脑；最后剥离并切取左侧斜方肌。所有标本置于4%多聚甲醛溶液中，保存于-20 ℃低温冰箱。②以ELISA 法行上述各组织中VIP、NPY 含量检测。取上述各组织样本适量，常温后裂解匀浆，按照检测试剂盒说明步骤严格操作，在酶标仪上读取OD 值，最后导出数据进行统计分析。

1.7.3 斜方肌和C3～5椎间盘组织中LPS 检测以ELISA 法进行检测，方法同上，严格按说明书操作。

1.8 统计学方法所有数据资料采用SPSS24.0 统计学软件进行分析。计量数据以均数±标准差（）表示，进行方差分析及LSD-t检验；数据相关性检验采用Pearson 分析。设定α=0.05，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况空白组如常。模型组与中药组家兔经脾虚证NTCS 造模后，未见死亡，经评估合格全部纳入实验对象。

2.2 各组IF 丰度比较见表1。正常家兔体内几乎所有IF 均可以归属为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门4 大类，其中又以厚壁菌门和拟杆菌门占主体地位。经脾虚造模后，模型组与空白组厚壁菌门与拟杆菌门的丰度，差异有统计学意义（P＜0.05），提示家兔IF 失调已形成。经给药后，中药组与模型组此2 种菌群丰度比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示中药能有效改变菌群丰度，恢复正常的厚壁菌/拟杆菌比例。变形菌门和放线菌门丰度于实验前后比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），其病理影响可以忽略。

表1 各组IF 丰度比较

2.3 各组直肠、迷走神经、下丘脑和颈交感干中VIP、NPY 含量比较见表2。与空白组比较，模型组VIP 和NPY 在直肠、迷走神经、下丘脑和颈交感神经干中的含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组各相应组织内的VIP 和NPY 含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组直肠、迷走神经、下丘脑、颈交感干中VIP、NPY 含量比较 ng/mL

2.4 各组斜方肌、椎间盘中LPS 含量比较见表3。与空白组比较，模型组斜方肌和椎间盘内的LPS 含量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药组颈周组织内的LPS 含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组斜方肌、椎间盘中LPS 含量比较（EU/L）

2.5 IF 丰度与各组织中VIP、NPY 及LPS 水平的相关性Pearson 分析见图1、图2 及图3。各相应组织中VIP、NPY 及LPS 的水平变化与厚壁菌群丰度呈正相关性（P＜0.01），而与拟杆菌群丰度呈负相关性（P＜0.05）。

图1 IF 丰度与NPY

图2 IF 丰度与VIP

图3 IF 丰度与LPS

3 讨论

颈椎病之本，实则本于脾胃。《素问·通评虚实论》 云：“头痛耳鸣，九窍不利，肠胃之所生也。”《灵枢·口问》云：“故上气不足，脑为之不满，耳为之苦鸣，头为之苦倾，目为之眩。”《素问·经脉别论》云：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺。”均明确指出头痛眩晕等病症的主要原因是由胃肠失和、“上气不足”引起。头为诸阳之会，五脏六腑精气均通过经络上注于头，头颈部正常生理功能的发挥皆有赖于脾之“升清”作用而实现。《脾胃论·三焦元气衰旺》云：“上气不足……此三元真气衰惫，皆由脾胃先虚，而气不上行之所致也。”[5]进一步说明中气亏虚、脾不升清是引发头项强痛的根本原因。因此，NTCS 虽然名为颈椎病变，临证亦有若干分型，但其证仍以脾虚为本，其治当以健脾和胃、益气升清为法。

IF 寄生在宿主的肠道之中，与宿主的消化功能休戚相关，IF 失调即意味着胃肠道消化功能出现了紊乱[6]。因此，本实验中保持家兔脾虚腹泻状态，以便观测IF 失调对NTCS 发病的影响。VIP 与NPY 均为神经递质，其合成和分泌受IF 的重要调节，这些肽类物质均能影响血管舒缩并能诱导组织的免疫炎症反应[7-8]；LPS 为细菌内毒素，同样具有强烈的致炎性。故实验选取此三者作为IF 失调后产生的炎症信号指标。脾胃虚弱不能升清降浊则水谷精气不能上承头颈部而致痛，相当于IF 失调产生代谢紊乱，由此生成的炎症信号等可上传至头颈部而促进发病。本实验结果则证明了这一观点，即IF 失调确与NTCS 存在密切相关性：在NTCS 的发病过程中，由于IF 失调显著提升了模型组肠道、迷走神经、下丘脑和颈交感神经内VIP、NPY 及颈周组织中LPS 的含量（P＜0.05），使源自于肠道内的损伤信号上传至颈部，进而引发或加剧了颈部软组织诸如斜方肌和颈椎间盘的免疫炎症反应，见表2、表3、图1。而桂枝加葛根汤组则呈现了显著的IF 调节作用（P＜0.05），即通过恢复正常菌群比例，抑制VIP、NPY及LPS 等有害信号在相应部位内上传，从而消除颈周软组织的炎症以止痛。本实验中所观察到的这种通过肠道→迷走神经→下丘脑→颈交感神经的炎症信号上传途径实际上是对已知存在的肠-脑轴之深化和延续，可以称之为菌-肠-脑-颈交感轴。

肠-脑轴作为公认的肠道与脑之间的信息交换渠道，为IF 失调影响NTCS 奠定了既有的物质基础和靶向通路。同时，中医的经络学说也为菌-肠-脑-颈交感轴的存在提供了理论依据。《灵枢·经脉》云：“（足阳明胃经）其支者，从大迎前，下人迎，循喉咙，入缺盆，下膈，属胃，络脾。”表明足阳明胃经支脉循行经过了腹部与颈部，提示肠道与颈部的病理变化确有联系。而菌-肠-脑-颈交感轴恰与胃经支脉的循行路线相符，说明该通路亦应具有调节肠-颈功能的作用，可视为胃经支脉物化的代表。

桂枝加葛根汤之所以能对以NTCS 为代表的颈肩痛症取得良好效果，历千年而不衰，堪为后世圭皋，其中一个重要原因就是它实际上揭示了脾胃与颈椎之间的密切联系，即脾胃功能深刻影响着颈项部的病理变化，这也是为什么通过调节IF 能治疗NTCS 的理论基础。如果说活血化瘀、祛风除湿或者补益肝肾才是NTCS 的主导治法，医圣为何舍桃仁、红花、川芎之通络，弃熟地黄、山萸肉、山药之滋补，而全部以归脾、胃二经的葛根、桂枝、白芍，甘草、姜、枣入药？如果仅认为桂枝汤意在疏通血脉，那加入葛根四两之重又是何意？细审立方之旨，可见处处着眼于顾护脾胃之气，通过升发中焦之清气以愈颈项之痉挛掣痛。本课题从调节IF 角度分析了桂枝加葛根汤治疗NTCS 的作用机制，丰富了经方治病的理论内涵，也为从脾胃出发防治颈椎病提供了新的实验依据，希望未来有更多的研究关注于此。