杨策,余婉莹,王文祥,李宁,易东阳,谭小燕
1. 重庆三峡医药高等专科学校,重庆 404120
2. 三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室,重庆 404120
3. 重庆文理学院,重庆 402160
非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌病理分类中最常见的类型,是除小细胞肺癌(SCLC)以外,所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合体。NSCLC 的常见类型有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌。其临床治疗以化疗为主,也有多种靶向药物治疗,但预后效果并不理想[1]。因此,寻找治疗NSCLC 的新靶点具有重要的临床意义。研究显示,多种中药成分及其提取物具有较好的抗肿瘤作用,如苦参碱、染料木素和紫杉醇,部分已广泛应用于临床[2-3]。桔梗在临床上常用于治疗咳嗽痰多、肺痛吐脓等症,为肺经之要药。药理学研究证实,桔梗具有抗氧化、抗炎、抗癌等药理作用,能抑制多种肿瘤细胞增殖[4]。然而,桔梗治疗NSCLC 的报道较少,其作用机制也尚未明确。因此,明确桔梗治疗NSCLC 的分子机制可以为桔梗防治NSCLC 提供更多参考。“成分-靶点-通路”网络关系中,多成分、多靶点、多途径的特点体现了中医治疗的整体观念。本研究基于网络药理学探讨桔梗治疗NSCLC 的活性成分和可能的分子机制,并通过体外实验验证了相关靶基因的相对表达量,结果报道如下。
1.1 材料A549 细胞株(中国科学院上海细胞库);桔梗(中国食品药品检定研究院,批号121028-201612);RPMI 1640 培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);涡旋混合器(美国赛洛杰克仪器有限公司,MX-F);聚合酶链式反应引物(北京擎科生物科技有限公司);ELX800TM酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);MCO-15AC 细胞培养箱(日本三洋公司);磷酸盐缓冲液(PBS)、Trizol 试剂(碧云天生物技术有限公司)。
1.2 潜在作用靶点筛选通过中药系统药理学数据库与分析平台数据库(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)获得桔梗的化学成分,根据口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18,筛选桔梗的潜在活性成分。将桔梗的潜在活性成分导入Swiss Target Prediction(https://Swiss.com/)和PharmMapper 数据库(https://www.PharmMapper.org/)中,获取相关的靶点信息。然后将筛选得到的靶点导入Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/),将检索出的蛋白名统一转换为基因名。在TTD(http://db.idrblab.net/ttd)和DrugBank 数据库(https://www.drugbank.com)中得到与NSCLC 相关的疾病靶点信息。最后通过Venny 2.1.0在线平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)筛选桔梗活性成分靶点与NSCLC 疾病靶点的交集靶点,得到桔梗治疗NSCLC 的潜在作用靶点。
1.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI) 网络构建在STRING 数据库(https://string-db.org)中导入交集靶点。置信度设定为“high confidence=0.4”,生物种类设定为“Homo sapiens”,其余的相关设置均为默认设置,获得PPI 网络及相关网络数据文件。将网络数据文件导入CytoScape 3.9.1 软件(https://cytoscape.org/),建立PPI 网络可视化图。用Network Analyzer模块进行网络可视化分析,获得度值(Degree)、节点介度(Betweenness)、节点紧密度(Closeness)的信息。度值越大表明该节点在网络中越重要。
1.4 基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析将筛选的桔梗治疗NSCLC 的潜在靶点导入DAVID 6.8 平台中,通过GO功能及KEGG 通路进行富集分析。对潜在靶点进行GO 功能分析,以研究桔梗活性成分治疗NSCLC 的主要生物功能,如生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF),并根据P值使用生物信息分析平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制柱状图。进行KEGG 通路分析,通过Omicshare(https://www.omicshare.com/)绘制气泡图,将结果进行可视化,以分析桔梗治疗NSCLC 的潜在作用机制。
1.5 “成分-靶点-通路”构建与分析将活性成分与潜在作用靶点通过CytoScape 3.9.1 软件筛选结果导入,并展开网络可视化分析,根据节点和边显示靶点与关键化合物间的关系。再利用Network Analyzer功能进行网络拓扑学分析,其中分析参数含节点介度中心性、节点紧密度和度值等,经拓扑学参数比对,确定化合物在网络中的重要性,分析主要活性成分及核心靶点。
1.6 分子对接筛选出桔梗治疗NSCLC 的活性成分和核心靶点,通过RCSB PDB 数据库(https://www.rcsb.org)下载核心靶点的3D 结构。将核心靶点的3D结构导入分子对接软件进行去水、加氢、能量最小化等操作,通过Glide Dock 模块进行分子对接,以对接评分评价活性成分与核心靶点结合的稳定性。
1.7 体外实验验证
1.7.1 细胞分组及给药37 ℃、5%二氧化碳(CO2)饱和湿度下,将A549 细胞培养于RPMI 1640 培养液中(10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素及0.1 mg/mL 链霉素)。实验组别设置为空白对照组(A549 细胞,不加药物干预),桔梗提取物低剂量组(40 μg/mL),桔梗提取物高剂量组(80 μg/mL)。
1.7.2 细胞活性实验采用CCK-8 试剂盒进行细胞活性检测。将A549 细胞浓度调至1×104个/mL,以100 μL/孔接种于96 孔板中,于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育24 h 后,对各组细胞进行药物处理,每组6 个复孔。药物作用24 h 后,每孔加入CCK-8 试剂10 μL 并摇匀,于CO2培养箱孵育1 h,于450 nm 下测定吸光度值,每孔测3 次,取平均值并计算细胞存活率。
1.7.3 桔梗提取物对调控通路基因的mRNA 相对表达的影响A549 细胞经桔梗提取物干预24 h 后,弃去培养基,以PBS 清洗5 次,并加入Trizol 试剂1 mL,室温放置10 min 后,收集至2 mL EP 管中,于260 nm 处测吸光度值,并确定RNA 浓度。采用逆转录试剂盒将mRNA 逆转录至cDNA。逆转录后采用20 μL 体系进行qPCR 检测,测定mRNA 相对表达量,结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。
1.8 统计学方法使用GraphPad Prism 8.0 统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差()表示,多组间比较使用单因素方差分析,两两比较采用LSD 法检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 桔梗治疗NSCLC 潜在作用靶点通过TCMSP检索共得到102 个桔梗化学成分。符合筛选条件的潜在活性成分共7 个,见表1。合并Swiss Target Prediction 数据库和PharmMappe 数据库中桔梗活性成分的靶点信息,去重复后获得285 个药物靶点。合并DrugBank 数据库和TTD 数据库的疾病靶点信息,去重后获得165 个与NSCLC 相关的疾病靶点。将桔梗活性成分靶点与NSCLC 疾病靶点取交集,得到桔梗治疗NSCLC 的靶点35 个,交集靶点韦恩图见图1。
图1 交集靶点韦恩图
表1 桔梗活性成分靶点信息
2.2 PPI 网络构建PPI 网络图中节点代表交集靶点蛋白,节点颜色越深代表相互关联度越强,见图2。从图中可知,白蛋白(Alb)、表皮生长因子受体(EGFR)、乳腺癌抵抗蛋白(ABCG2)、前列腺素内过氧化合物酶2(PTGS2)、P-糖蛋白(ABCB1)、非受体酪氨酸激酶(SRC)等可能是桔梗治疗NSCLC 的关键靶点。
图2 PPI 网络图
2.3 GO 功能富集分析设定P<0.05,总共得到167 条富集通路,其中94 个通路与BP 相关,26 个通路与CC 相关,47 个通路与MF 相关。根据P值由小到大排列,分别选取BP、CC、MF 中前10 条绘制柱状图,见图3。BP 主要涉及异生刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)、药物反应(response to drug)、凋亡信号通路(negative regulatioin of apoptotic process)等;CC 主要涉及质膜(plasma membrane)、细胞核(nucleus)、细胞质(cytoplasm)等;MF 主要涉及三磷酸腺苷结合(ATP binding)、蛋白结合(identical peotein binding)等。
图3 GO 富集分析图
2.4 KEGG 通路富集分析设定P<0.05,采用KEGG 通路富集对35 个潜在作用靶点进行分析,共获得42 条富集通路,按照P值依次增大的排列顺序,筛选出前20 条与NSCLC 相关的通路。气泡的颜色代表富集的显著性,气泡越红说明差异基因在这个通路上富集越显著。见图4。
图4 KEGG 富集通路气泡图
2.5 “成分-靶点-通路”可视化网络见图5。获得7 种化学成分,包括刺槐黄素、菠菜甾醇、花旗松素、2-O-甲基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸酯A、木犀草素、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯、刺槐素。与化学成分相互作用联系的35 个基因靶点主要有ABCB1、PTGS2、EGFR、Alb、SRC、ABCG2 等。与桔梗治疗NSCLC 有关联的信号通路主要有癌症通路(pathway in cancer)、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、Rap1 信号通路(Pap1 signaling pathway)、FoxO 信号通路(FoxO signaling pathway)等。
图5 成分-靶点-信号通路网络
2.6 分子对接见图6。花旗松素与PTGS2、木犀草素与ABCB1 和PTGS2、刺槐素与EGFR 等对接评分较高。选取ABCB1、EGFR、PTGS2 与其对接评分最高的活性成分进行可视化,见图7。
图6 分子对接评分热图
图7 分子对接可视化图
2.7 体外实验验证见图8。给药24 h 后,与空白对照组相比,桔梗提取物低剂量组A549 细胞活性下降(P<0.05),桔梗提取物高剂量组A549 细胞活性低于桔梗提取物低剂量组(P<0.05)。qPCR 实验结果显示,与空白对照组相比,桔梗提取物低剂量组A549 细胞中ABCB1、EGFR、PTGS2 mRNA 表达量均降低(P<0.05),桔梗提取物高剂量组A549 细胞中ABCB1、EGFR、PTGS2 mRNA 表达量均低于桔梗提取物低剂量组(P<0.05)。
图8 桔梗提取物对A549 细胞活性及核心靶点基因表达的影响
中医药作为补充和替代医学被广泛用于改善接受肿瘤切除术后化疗、放疗或免疫治疗的NSCLC 患者的生活质量。研究发现,桔梗中的桔梗皂苷D 与异类叶升麻苷可通过调控EphA2/AKT/mTOR 通路和调节TNF-α、IL-6 来抑制A549 细胞增殖、迁移和侵袭[5]。桔梗皂苷D 还可以通过下调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA和蛋白的表达及抑制其上游ERK 信号通路和p-AKT表达,进而抑制NSCLC H460 和A549 细胞的黏附、侵袭和迁移[6]。但迄今为止桔梗治疗NSCLC 的作用机制仍不明确。网络药理学基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络,为系统发现中药活性成分及作用靶点提供新的策略[7]。因此,本研究结合网络药理学、分子对接及分子生物学等方法,深入挖掘桔梗的有效成分,阐明其治疗NSCLC 可能的作用机制。
从TCMSP 中检索得到102 个桔梗化学成分,根据OB 和DL 筛选得到7 个潜在活性成分。其中刺槐黄素具有抗氧化和抗炎作用,有研究表明刺槐黄素显著降低了p38 α-cDNA 转染细胞中磷酸化p38 α 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、MMP-2/MMP-9 及尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)水平,从而显著降低了NSCLC A549 细胞的侵袭及迁移[8-9]。花旗松素可以通过促进胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和OCT4 失活来抑制肺癌细胞干性和上皮-间质转化作用,同时能通过降低SOX2 和OCT4 表达来抑制A549 异种移植BAlb/c小鼠的肿瘤生长[10]。木犀草素可以通过抑制Hsp90 与突变型EGF 受体的结合来诱导EGF 受体降解,从而阻止PI3K/Akt/mTOR 信号传导,加速NSCLC A549细胞凋亡[11]。其余潜在活性成分未见治疗NSCLC 的相关报道。
PPI 网络分析表明,Alb、EGFR、ABCG2、PTGS2、ABCB1 及SRC 为桔梗治疗NSCLC 的核心靶点。研究表明,EGFR 靶点联合检测血清ProGRP、NSE 可有效提高诊断晚期NSCLC 的效能[12]。NSCLC 患者体内Alb 降低是发生癌痛的独立危险因素[13]。ABCG2靶点的高表达与肺癌患者术后复发转移呈正相关关系,表明ABCG2 靶点可作为预测肺癌复发的重要指标[14]。SRC 蛋白激酶在正常组织的细胞中广泛表达,当SRC 过度表达时,可能会导致癌症的发生。在NSCLC 患者机体中,SRC 的过度表达与不良的预后以及促进迁移、侵袭、转移和耐药有关[15]。
通过GO 和KEGG 通路富集分析交集靶点,结果表明桔梗主要通过作用于癌症通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、MAPK 信号通路、Rap1 信号通路、FoxO 信号通路等发挥治疗NSCLC 的作用。相关研究表明,桔梗可通过激活T 细胞促进抗肿瘤作用,癌症通路的调节至关重要[16];EGFR 信号通路也能影响到突变晚期NSCLC 的表达[17];桔梗还可通过抑制MAPK 通路及PI3K/AKT 通路的活化治疗NSCLC小鼠肺组织部位[18];桔梗可抑制细胞质Rap1 靶点,进而介导下游炎症及凋亡通路,有效提升机体对NSCLC 化疗药物的耐药性[19];化疗药物具有细胞毒性,可促使细胞凋亡,桔梗能抑制FoxO 信号通路,从而降低细胞对化疗药物的敏感性,提升治疗NSCLC 的药效[20]。
针对以上预测结果,以qRT-PCR 进行验证实验,结果表明ABCB1、EGFR、PTGS2 等核心靶点可能是桔梗治疗NSCLC 的有效靶点。EGFR 是受体酪氨酸激酶ErbB 家族的一员,可以与受体特异性配体结合形成同源和异源二聚体,二聚体的形成可以促进酪氨酸激酶的激活。酪氨酸残基的自动磷酸化启动了一系列下游信号转导通路。EGFR 信号通路对细胞生长、增殖和分化的生理过程有重要影响,EGFR是抗NSCLC 药物的最佳靶点[21]。MAPK 和PI3K-AKT信号通路是EGFR 的主要下游通路,分别参与细胞增殖、细胞存活和运动[22]。ERK 和AKT 的激活在肿瘤的细胞生长和细胞分裂中起重要作用。抑制MAPK和PI3K-AKT 信号通路有望成为治疗NSCLC 的有效方法[23]。SRC 的过度表达与促进迁移、侵袭、转移和耐药有关,SRC 被多种受体酪氨酸激酶(RTKs)激活时,与局部粘着斑激酶(FAK)相互作用,然后通过肾素-血管紧张素系统(RAS)和Raf 蛋白激酶(RAF)导致丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK)-磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)和细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)的激活,最终促进肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成[24]。PCR 实验结果表明,桔梗提取物能够有效调控以上靶点,进而改善NSCLC,且可能呈现一定的剂量依赖性。
综上所述,本研究利用网络药理学、分子对接及分子生物学的方法探讨了桔梗治疗NSCLC 的分子机制。研究表明桔梗可能通过靶向ABCB1、EGFR、PTGS2 等靶点调节MAPK 等信号通路,进而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。桔梗可通过多成分、多靶点、多途径发挥治疗NSCLC 的作用。然而,由于本研究是基于基因层面分析,还需要来自体外和体内更加深层次的研究来验证。