miR-21、miR-26a及miR-200a在子痫前期患者中的表达水平及与病情的相关性

刘菊菊,苏 敏,薛 璇

(1.南京市妇幼保健院产科,江苏 南京 210000;2.南通大学附属医院妇产科,江苏 南通 226001)

子痫前期(preeclampsia,PE)主要发生在妊娠20周以后,主要特征是高血压、蛋白尿和水肿,严重时会对孕妇的肝、肾、心脏等器官造成损伤,常伴有妊娠不良结局的发生,是造成孕妇和围生儿死亡的主要原因之一[1-2]。目前,PE发病机制尚不明确,且临床上缺乏有效的早期PE检测标志物。因此,寻找一种能预测PE进展的检测标志物对缓解PE进展及改善妊娠结局具有十分重要的意义。

微小RNA(microRNA,miRNA)是长度为18～25nt的内源性非编码RNA,已被发现在胎盘滋养细胞增殖、凋亡、分化等过程中起重要的调节作用,可参与PE的发生发展[3-4]。miR-21、miR-26a和miR-200a已被发现与多种肿瘤的发生发展密切相关[5],但它们在PE发病中的研究较少。董坤[6]等人的研究发现,miR-21在PE患者中的表达水平显著升高。董丽宏[7]等人报道称,miR-26a在妊娠高血压患者的血浆中高表达,且过表达miR-26a可显著抑制滋养层细胞的增殖和侵袭。另有研究表明,miR-200a在妊娠糖尿病患者的外周血中表达显著升高[8]。因此,我们推测,血清中miR-21、miR-26a和miR-200a的表达水平可能与PE的发生发展及不良妊娠结局相关。本研究通过检测PE患者血清中miR-21、miR-26a和miR-200a的表达,探讨其表达水平与PE进程及妊娠结局的相关性,以期为PE的早期诊断及预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料

选取2019年3月至2021年3月在南京市妇幼保健院治疗的PE患者103例,将其分为轻度PE组(57例)和重度PE组(46例)。子痫前期的诊断标准为:妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24小时或随机尿蛋白≥(+)。重度子痫前期诊断标准为:子痫前期患者出现下述任一不良情况可诊断为重度子痫前期:①血压持续升高:收缩压≥160mmHg和(或)舒张压≥110mmHg。②蛋白尿≥2.0g/24小时或随机蛋白尿≥(++)。③血清肌酐≥1.2mg/dL。④血小板<100×109/L。⑤微血管病性溶血—LDH升高。⑥血清转氨酶水平升高—ALT或AST。⑦持续头痛或其他大脑或视觉障碍。⑧持续上腹部疼痛。另选取同期正常50例孕妇作为对照。其中,轻度PE组孕妇年龄24～34岁,平均(28.92±4.89)岁,平均孕周(24.12±1.33)周;重度PE组孕妇年龄25～36岁,平均(29.32±3.96)岁,平均孕周(24.37±0.98)周;对照组孕妇年龄24～35岁,平均(29.77±4.17)岁,平均孕周(24.66±1.03)周。三组孕妇在平均年龄及平均孕周等方面差异无显著性(P>0.05)。本研究经南京市妇幼保健院伦理委员会批准,且所有患者及其家属均已签署知情同意书。

1.1.2 纳入及排除标准

纳入标准:①所有患者均符合第八版《妇产科学》中关于PE的相关诊断标准[9];②对照组孕妇无任何妊娠合并症,无蛋白尿,且胎儿发育正常;③所有孕妇均为初次妊娠,且均为自然受孕。排除标准:①有高血压、糖尿病、心脏病及肾病病史的患者;②有结核或肝炎等急慢性传染病的患者;③有免疫性疾病的患者;④出现胎盘早剥、胎盘前置或胎膜早破的患者。

1.1.3 主要试剂与仪器

miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒、SYBR Green PCR 试剂盒(德国Qiagen);逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific);实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems);Cobas 8000 全自动生化分析仪(瑞士罗氏)。

1.2 方法

1.2.1 血清miRNA提取

于清晨在各组孕妇空腹状态下采集静脉血5mL,4℃、3 000r/min离心15min后收集上清液,并将其置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.2 miR-21、miR-26a和miR-200a表达水平检测

用miRNeasy Serum/Plasma试剂盒提取总RNA,然后将其浓度调整为1μg/μL;通过逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA,然后通过SYBR Green PCR试剂盒检测血清中miR-21、miR-26a和miR-200a的表达水平,以U6为内参基因。PCR反应条件为: 95℃ 15 min,95℃ 15s,60℃ 35s,70℃ 20s,共35个循环。采用2-ΔΔCt法计算血清miR-21、miR-26a和miR-200a的相对表达量。所有引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 观察指标

比较各组孕妇的年龄、孕周、身体质量指数(BMI)、血压、24h尿蛋白等临床资料和血清miR-21、miR-26a及miR-200a的相对表达量。对所有孕妇进行跟踪随访,以完善各组孕妇的妊娠结局及新生儿的健康情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组研究对象临床资料比较

各组研究对象在年龄、孕周等方面差异无显著性(P>0.05);与对照组相比,轻度PE组患者BMI、舒张压、收缩压及24h尿蛋白显著升高(P<0.05);与轻度PE组患者相比,重度PE组患者舒张压、收缩压及24h尿蛋白显著升高(P<0.05)。结果详见表2。

表2 各组研究对象临床资料比较

2.2 各组研究对象血清miR-21、miR-26a及miR-200a表达水平比较

本研究通过qRT-PCR检测miR-21、miR-26a及miR-200a在对照组、轻度PE组及重度PE组孕妇血清中的表达。结果发现,与对照组相比,miR-21、miR-26a及miR-200a在PE患者中的表达均显著上调(P<0.05);且miR-21、miR-26a及miR-200a在重度PE组孕妇中的表达显著高于轻度PE组(P<0.05)。结果详见图1。

注:A:miR-21在各组研究对象血清中的表达;B:miR-26a在各组研究对象血清中的表达;C:miR-200a在各组研究对象血清中的表达。与对照组相比,*P<0.05;与轻度PE组相比,#P<0.05。

2.3 各组研究对象不良妊娠结局的比较

与对照组相比,轻度PE组及重度PE组早产、低体重儿、巨大儿及胎儿死亡的发生率显著升高(P<0.05);且与轻度PE组相比,重度PE组不良妊娠结局的发生率显著升高(P<0.05)。结果详见表3。

表3 各组研究对象不良妊娠结局比较

2.4 血清miR-21、miR-26a及miR-200a表达水平与一般资料及不良妊娠结局的相关性分析

Pearson相关分析结果显示,miR-21、miR-26a及miR-200a的表达均与舒张压、收缩压、24h尿蛋白、早产、低体重儿、巨大儿、胎儿死亡呈正相关(P<0.05),而与年龄、孕周和BMI无相关性(P>0.05)。结果详见表4。

2.5 血清miR-21、miR-26a及miR-200a对PE诊断价值的分析

通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miR-21、miR-26a、miR-200a及三者联合诊断PE的效能,结果发现,血清miR-21、miR-26a、miR-200a及三者联合诊断PE的曲线下面积(AUC)分别为0.930(95%CI:0.875～0.984)、0.908(95%CI:0.856～0.960)、0.746(95%CI:0.635～0.839)及0.967(95%CI:0.935～0.998),这提示联合检测有助于提高诊断效能。进一步分析血清miR-21、miR-26a、miR-200a及三者联合对PE诊断的特异性和敏感度,结果发现联合诊断能提高检测的敏感度和特异性。结果详见表5和图2。

图2 血清miR-21、miR-26a及miR-200a预测PE的ROC曲线

表5 血清miR-21、miR-26a及miR-200a对PE诊断价值的比较

3 讨论

3.1 PE的早期诊断生物标志物仍然缺乏

PE在孕妇中的发病率高达4%～8%,且近年来呈上升趋势,多数患者发生在孕中后期。PE患者多伴有蛋白尿、严重高血压、水肿、呕吐、头痛、全身小动脉痉挛等症状,是导致产妇和胎儿死亡主要原因之一[10-11]。另有研究表明,有PE病史的女性其后代在妊娠时发生PE的风险会显著增加,且其今后患心血管疾病的风险也会显著增加[12]。虽然随着人们产前检查意识的增强,PE的发生率已经有了一定程度的控制,但由于病情进展较为迅速,一经发现,孕妇和胎儿已经受不同程度的伤害,因此,寻找一种灵敏、有效的PE早期诊断生物标志物是十分重要的。

3.2 miR-21、miR-26a及miR-200a既往研究

miRNA已被证明在多种生物学及病理学过程中起调控作用,有证据表明妊娠期孕妇外周血中可检测到多种miRNA的表达,且其与孕龄、不良妊娠结局等相关,这说明miRNA表达可能是检测妊娠疾病新型诊断工具[13]。有研究发现,miR-21在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、凋亡等多种生物学过程中扮演重要角色,是目前发现的唯一在多种实体瘤及非实体瘤中高表达的miRNA,也是第一个在肿瘤患者血清中检测到的miRNA[14-15]。胎盘组织中miR-21的表达与胎儿生长受限的发生密切相关,且miR-21在重度PE患者胎盘组织中的表达显著升高[6,16]。miR-26a位于人3号染色体,在多种组织中表达。有研究发现,miR-26a可在胃癌、肺癌、肝癌及乳腺癌中发挥抑癌作用[17-18]。杨莹等[19]发现miR-26a在PE患者胎盘组织中的表达显著升高,且miR-26a的表达与患者的病情程度呈正相关。miR-200a是miR-200家族的重要成员之一,在多种恶性肿瘤中扮演抑癌基因的角色。有研究发现,miR-200a在非小细胞肺癌患者外周血中表达上调[20]。另外,miR-200a也可作为血清标志物,判断结直肠癌患者的预后[21]。黄丽斯等[8]研究证明,miR-200a在妊娠糖尿病患者外周血及胎盘组织中的表达显著升高,但目前并无miR-200a与PE相关的报道。而同为miR-200家族的另一成员,miR-200c已被证明在PE患者胎盘组织中的表达显著升高[22]。

3.3 miR-21、miR-26a及miR-200a表达水平与PE的新发现

本研究结果显示,PE组miR-21的表达水平显著高于对照组,与之前的研究结果一致。在此基础上,本研究还发现miR-21的表达水平与PE患者的病情严重程度呈正相关。另外,我们将miR-21的表达水平与临床指标及不良妊娠结局进行相关性分析,结果发现miR-21的表达与PE患者的舒张压、收缩压、24h尿蛋白及不良妊娠结局呈正相关。本研究显示PE患者胎盘组织中miR-26a表达显著升高,且miR-26a表达水平与病情程度呈正相关。此外,本研究还进一步分析了miR-26a表达与患者舒张压、收缩压、24h尿蛋白及不良妊娠结局的相关性,发现它们之间呈正相关。在本研究中,我们首次发现miR-200a在PE患者外周血中的表达显著升高,且其表达水平与PE患者的病情严重程度呈正相关。我们同样发现,miR-200a的表达水平与PE患者的舒张压、收缩压、24h尿蛋白及不良妊娠结局呈正相关。

综上所述,PE患者胎盘组织miR-21、miR-26a和miR-200a水平呈现高表达,三者联合检测PE时的诊断价值更高。本研究对早期预测及诊断PE,评估患者预后具有重要的意义。但由于本研究的样本量不大,结果存在一定的局限性。因此,后续还需要进行更大样本量的研究,以及对调节机制的深入研究。