红叶石楠叶斑病病原菌生物学特性研究

冯雪 欧阳汝欣 冯蕾

(衡水学院生命科学学院，河北 衡水 053000)

红叶石楠(Photinia×fraseri)是一种常绿的小乔木或灌木，属于石楠科石楠属，常见品种包括红罗宾、红唇等，在春秋两季会展现出鲜红的新叶，色彩艳丽持久，极具生机。红叶石楠具有适应性强、耐旱耐贫瘠、抗病虫害等优点，因其美丽的颜色和独特的形态被广泛种植于园林和城市绿化中，有“红叶之王”“绿叶之王”之称。近年来，对衡水市区红叶石楠病害调查发现，叶斑病发展迅速且呈严重态势，其病原菌孢霉主要侵染红叶石楠老叶，常发生在春季相对温暖的天气，通常在6月上旬开始出现。发病初期，叶表面会出现黄色斑点，呈环状褐色晕环，严重时出现白粉和棕粉斑点等大量沉淀物，叶边缘出现紫色斑点，叶斑病后期叶片会呈褐色斑点病变，直至全叶皱缩枯黄。红叶石楠叶斑病病原菌可以多次侵染，反复发生，严重影响了红叶石楠的观赏和应用价值[1]。为此，有必要对其病原菌进行生物学特性研究，预测红叶石楠叶斑病病害的发生规律，并有效防治其发生。

目前，围绕着红叶石楠的生态保护、园林应用、繁殖技术、基因资源、药用价值和文化价值等方面展开了大量研究，但对于红叶石楠病害方面的研究基本空白。因此，本课题以在植物实验室分离鉴定得到的红叶石楠叶斑病病原菌为供试菌株，从温度、pH值、碳源、氮源等4个影响因素入手，系统研究该病原菌的生物学特性，包括菌丝生长和产孢量等，为红叶石楠叶斑病病害的正确诊断和及时准确预测预报奠定了理论基础[2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料与试验地点

供试菌株：园林植物和微生物实验室内分离鉴定得到的红叶石楠叶斑病病原菌；供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、察氏培养基(Czapek)；试验时间：2022年9月—2023年6月；试验地点：微生物实验室、园林植物实验室。

1.1.2 仪器设备与试剂

所用仪器：立式压力蒸汽灭菌器(重庆雅马拓科技有限公司)、超净工作台、恒温培养箱、电子天平、生物显微镜；所用试剂：果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、硝酸钠、氯化铵、蛋白胨、尿素、甘氨酸、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、琼脂等。

1.2 试验方法

1.2.1 不同温度对红叶石楠病原菌菌丝生长和产孢的影响

设置5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃共7个温度梯度，使用5mm打孔器在PDA培养基上接种红叶石楠叶斑病病原菌菌饼。置于7个恒温培养箱中，并分别设置以上7个温度梯度恒温培养，每个处理进行3次重复。以上7个温度处理在培养箱中培养5d后，拍照记录菌丝生长情况，并用十字交叉法测量菌落直径，培养8d后，用10mL无菌水洗涤培养基表面且用毛笔刷下菌丝体，将其倒入90mL无菌水中，置于恒温振荡器中振荡24h后，每皿取5μL菌悬液，共取3次，在显微镜下镜检记录孢子数量，取3次孢子数平均值[3]。

1.2.2 不同pH值对叶斑病原菌菌丝生长和产孢的影响

用盐酸和氢氧化钠溶液将PDA培养基的pH分别调至4、5、6、7、8、9，接种方法与数据处理同1.2.1，每个处理重复3次。以上5个处理在培养5d后，拍照记录菌丝生长情况，并用十字交叉法测量菌落直径，再培养3d后，用10mL无菌水洗涤培养基表面且用毛笔刷下菌丝体，将其倒入90mL无菌水中，置于恒温振荡器中振荡24h后，每皿取5μL菌悬液，共取3次，在显微镜下镜检记录孢子数量，取3次孢子数平均值[4]。

1.2.3 不同碳源对病原菌菌丝生长和产孢的影响

以等量的果糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇替换Czapek培养基中的蔗糖，分别配制成含5种不同碳源的培养基，以剔除蔗糖的Czapek培养基作为空白对照组。接种方法与数据处理同1.2.1，每个处理进行3次重复。测定不同碳源对菌丝生长和产孢的影响。

1.2.4 不同氮源对病原菌菌丝生长和产孢的影响

以等量的氯化铵、蛋白胨、甘氨酸、尿素替换Czapek培养基中的硝酸钠，分别配制成含5种不同氮源的培养基，以剔除硝酸钠的Czapek培养基作为空白对照组。接种方法与数据处理同1.2.1，每个处理进行3次重复。测定不同氮源对菌丝生长和产孢的影响。

1.2.5 数据计算与分析

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计，分析对不同温度、pH值、碳氮源对病原菌产孢量的数据进行差异的显著性检验，采用Microsoft Excel 软件对数据进行处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

由表1可知，红叶石楠叶斑病病原菌在不同温度条件下菌丝产孢量和生长速度差异明显。在10～35℃范围内均可生长和产孢，菌丝最适生长温度为25℃，此时该菌的生长速度最快，产孢量也最大，达2.08×106个/皿，菌丝长势良好，菌丝洁白且致密[5]；30℃次之；20℃和35℃时，病原菌的生长速度接近，长势中等；10℃时生长速度较慢，菌丝长势较差；温度为5℃时无菌落生长。菌落的生长速度和产孢量的排序均为25℃>30℃>20℃>15℃>10℃>35℃>5℃，可见，红叶石楠叶斑病病原菌孢子对于温度的产孢最适条件为25℃。

表1 不同温度对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.2 不同pH值对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

由表2可知，pH在4～9范围内时红叶石楠叶斑病病原菌均可生长和产孢。当pH在7左右时，菌丝繁殖速度较快，产孢量也较大，当pH趋于碱性或趋于酸性时，菌丝生长量及产孢量均呈现为下降趋势。当pH为7时，菌丝长势良好，颜色雪白且有密集的纹理，菌落直径和产孢量最大分别为80.65mm和5.12×106个/皿。当pH为8时，菌丝生长速度较快，颜色白色，也有可见的细密纹理。pH为6和9时，菌丝生长速度非常接近都呈中等水平，菌丝也有较为细密的纹理。pH为4和5时生长速度较慢，菌丝颜色浅白且文理不清晰。菌落的生长速度和产孢量的排序均为pH7>pH8>pH6>pH9>pH5>pH4。可见，该叶斑病病原菌孢子最适生长pH为7。

表2 不同pH值对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.3 不同碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

由表3可知，以果糖为碳源时，叶斑病病原菌生长速度最快，菌落直径最大，可达73.95mm，菌丝长势良好，颜色雪白且有可见的细密纹理，产孢量最大，最多达5.13×105个/皿。以蔗糖为碳源时的菌丝生长速度较快，颜色白色且呈现出较为细密的纹理。以果糖或甘露醇为碳源时，生长速度中等，长势良好。山梨醇为碳源时生长速度较慢，菌丝颜色浅白且长势较差。在空白对照的PDA培养基上也可生长，但菌落极稀薄且不产孢。可见，红叶石楠叶斑病病原菌孢子对各种碳源的吸收都比较好。该病原菌的生长速度和产孢量的排序均为果糖>蔗糖>葡萄糖>甘露醇>山梨醇>空白对照，最适碳源为果糖。

表3 不同碳源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

2.4 不同氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

由表4可知，氮源为硝酸钠时生长速度最快，菌落直径最大，可达82.23mm，菌丝洁白致密，长势良好。产孢量也最大，最多达1.67×106个/皿。以甘氨酸为碳源时生长速度较快，产孢量也较多，长势良好。蛋白胨和氯化铵作为碳源时，生长速度接近，长势中等。尿素为碳源时生长速度较慢，菌丝颜色浅白且长势较差。在空白对照的PDA培养基上，病原菌可生长，菌落极稀薄，不产孢。菌落的生长速度和产孢量的排序均为硝酸钠>甘氨酸>蛋白胨>氯化铵>空白对照>尿素。可见，硝酸钠最利于病原菌菌丝生长和产孢，即最适氮源。

表4 不同氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响

3 结论与讨论

研究植物病害病原物在植物保护、环境保护、生态系统保护和发展以及相关学科的发展等多方面均有重要意义，本研究首次系统地研究了衡水市红叶石楠叶斑病的病原菌在不同pH值、温度、碳源和氮源等因素下对其菌落生长和产孢量的影响，明确了该菌生长所需要的环境条件和营养条件，在一定程度上，可以深入了解红叶石楠叶斑病的发病规律，对于防治该病害的发生提供了一定的理论基础。研究结果显示，红叶石楠叶斑病病原菌菌丝的最适生长温度为20～30℃，在25℃时繁殖条件最佳，而在低于5℃或高于35℃时繁殖受到遏制，最适生长pH值为7。研究发现，该病原菌对碳源的适应性比较强，对各种碳源的吸收均较好，其中以果糖为最适产孢条件，这与文献中该类病原菌对碳源的适应性一致[6]。氮源主要为该菌提供氮素来源的营养物质，该菌对氮源的吸收有显著的差异，其中最适氮源为硝酸钠。由此可知，病原菌的生物学特性与病害发生和流行规律有着密切的关系。

由于研究时间的限制，本课题只对红叶石楠叶斑病病原菌产孢影响因素进行了基础的研究，除了小孢拟盘多毛孢之外，还存在一些其他的病原真菌，这些病原真菌的具体类型和它们之间存在某些关系，不同的培养基类型对各种病原菌产孢量是否有影响以及各种病原菌的盛发期均有待深入研究。在此基础上，还需进行杀菌剂、致病力以及红叶石楠品种抗性鉴定试验，筛选出可有效防治衡水地区红叶石楠叶斑病病原菌的化学药剂以及抗病品种，以期为综合防治提供一定的参考。