猪瘟病毒非结构蛋白NS4B与宿主蛋白相互作用的研究进展

邹 宏,罗 干,李 玲,夏应菊,徐 璐,赵俊杰,张乾义

(1. 中国兽医药品监察所,国家/WOAH猪瘟参考实验室,北京 海淀 100081 ;2. 重庆市万州区畜牧产业发展中心,重庆 万州 404100)

随着猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)C株疫苗株的发现[1],通过科学的生物安全防控措施和疫苗接种策略,猪瘟(Classical swine fever,CSF)在大多数国家已被成功消灭,但在一些养猪体量大的国家,如印度和越南等,猪瘟仍难以消灭,且还存在着慢性猪瘟和非典型猪瘟的流行,导致猪瘟的流行趋势更加复杂多样[2]。CSFV基因组长度约为 12.3 kb,包含1个开放阅读框和2个非编码区(Untranslated region,UTR),翻译成1种多聚蛋白[3],该多聚蛋白在病毒和宿主细胞酶的作用下形成4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B),这些蛋白在CSFV的复制、转录、翻译、致病作用和免疫逃避中发挥重要作用[4]。其中,非结构蛋白NS4B被证实参与CSFV生命周期内病毒的复制、翻译、致病作用和免疫逃避,但其具体机理尚不清楚[5]。

在黄病毒科(Flaviviridae)人兽共患传染病病原体中,登革热病毒(Dengue virus,DV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)等的NS4B蛋白已被大量研究报道[6]。通过对黄病毒科NS4B蛋白结构预测和核酸序列比对发现,CSFV的NS4B蛋白和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的同源性最高,研究发现CSFV和BVDV有相似的血清抗原,存在60%以上的同源性[7]。但关于CSFV和BVDV NS4B蛋白的相关研究报道较少,因此只能依赖其他黄病毒科NS4B蛋白的研究资料推导CSFV NS4B蛋白可能存在的相关作用机理,如其与DExD-box 解旋酶 39B(DExD-box helicase 39B,DDX39B)、核糖体蛋白L15(Ribosomal protein L15,RPL15)和核糖体蛋白S3(Ribosomal protein S3,RPS3)等蛋白的相互作用[8]。本文对CSFV NS4B蛋白的结构、功能及其与宿主其他蛋白的相互作用方面进行概述,以期为CSFV致病机理研究和感染防控提供参考。

1 CSFV非结构蛋白NS4B的结构和功能

通过对黄病毒科瘟病毒属NS4B蛋白的对比发现,CSFV非结构蛋白NS4B与BVDV相似性最高,也是一种疏水性膜蛋白[9],分子质量大小约为38 kDa,由NS3蛋白切割而来[10]。预测NS4B蛋白包含4个由跨膜区域隔开的内质网和细胞质结构域,两侧是位于细胞质中的 N 端和 C 端区域,C 端区域包含2个螺旋结构,N端区域包含2个保守的亲性螺旋,在NS4B蛋白被切割时可以变成跨膜结构域[11],且N端结构域在CSFV RNA复制和致病过程中发挥重要作用[12]。

Thompson等[13]在HCV非结构蛋白NS4B中发现了1个保守的核苷酸结合基序,该基序能水解三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate,GTP)和二磷酸鸟苷(Guanosine diphosphate,GDP),还具有核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate,NTP)激酶活性,对HCV的体外复制、细胞转化和肿瘤形成至关重要,且该基序在瘟病毒属中也同样存在。在CSFV中,该基序包含Walker A和Walker B两个基序,位于NS4B蛋白C末端氨基酸残基第209～216位和第335～342位[5]。Walker A基序由富含G的磷酸盐结合环组成,其共识序列为G/AXXXXGKS/T(其中X可以是任何残基),参与NTP的β-磷酸盐和γ-磷酸盐结合;Walker B基序由Asp残基组成,其前有一段疏水氨基酸(h)hhhhD或hhhhDD/E,能螯合Mg-NTP复合物的Mg2+,共识序列为DXXG[14]。Gladue等[5]通过进一步研究发现,CSFV NS4B蛋白的NBM基序同样能水解ATP、GTP和GDP,具有NTP激酶活性,这种活性是由Walker A和Walker B基序介导的。通过对Walker A或Walker B基序特定氨基酸的突变发现,Walker A基序对NTP激酶活性的影响大于Walker B基序,这可能与Walker B基序的高度保守有关。与其他瘟病毒属Walker A基序不同,CSFV NS4B蛋白中的Walker A基序在GKS/T特征序列中缺乏保守的K残基,其中K被V或I取代,K残基与NTP带负电荷的β-磷酸和γ-磷酸相互作用,从而在体外促进ATP和GTP的水解[15]。研究发现,NTP激酶活性可影响CSFV蛋白对核苷酸的结合和水解所介导的信号传导、膜运输和膜融合,在病毒复制、活力和毒力中起关键作用[16]。

Tamura等[17]鉴定出CSFV NS4B蛋白中不在NTP激酶基序内的2个氨基酸,分别位于N端第2 475位和C端第2 563位,取代这2个位置可以影响NS4B复制酶复合物的稳定性,并影响CSFV RNA复制的效率和病毒的毒力。此外,有研究在CSFV NS4B蛋白 C端区域中发现了Toll-白细胞介素-1受体(Toll-interleukin-1 receptor,TIR)样结构域,该结构域包含3个保守基序:box 1、box 2 和box 3[16]。TIR结构域能参与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)的信号转导,促进各种外源性或内源性微生物成分的识别,激活宿主免疫应答反应[18]。对CSFV强毒株(BICv)NS4B蛋白的box 1进行突变可导致病毒活力丧失;对box 2进行替换可导致病毒毒力衰减,仅在扁桃体中局部复制,表明TIR结构域不仅在CSFV复制中发挥作用,还参与CSFV的致病过程。

2 CSFV非结构蛋白NS4B与宿主蛋白的相互作用

黄病毒科病毒NS4B蛋白与其他蛋白的相互作用常有报道,如HCV NS4B蛋白抑制双链RNA触发的干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)介导的干扰素(Interferon,IFN)产生[19];DV NS4B蛋白的表达可通过干扰信号传导及转录激活蛋白1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)磷酸化来阻断IFN诱导的信号转导[20];BVDV中NS4B蛋白残基第15位的突变(Y至C)会导致病毒对细胞产生致病性[21]。在CSFV感染中,Lv等[22]也筛选出14种与NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白,包括DDX39B蛋白、细胞色素C氧化酶亚基 7C(Cytochrome C oxidase subunit 7C,COX7C)蛋白、铁蛋白重链(Ferritin heavy chain 1,FTH1)蛋白、线粒体抗病毒信号(Mitochondrial antiviral signaling,MAVS)蛋白、核受体亚族2,F组第6号成员(Nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6,NR2F6)蛋白、核糖体蛋白侧柄亚基 P1(Ribosomal protein lateral peduncle subunit P1,RPLP1)蛋白、26S蛋白酶调节亚基6B(26S protease regulatory subunit 6B,PSMC4)蛋白、纤维蛋白原样 2(Fibrinogen like 2,FGL2)蛋白、Makorin环指蛋白1(Makorin ring finger protein 1,MKRN1)蛋白、RPL15蛋白、RPS3蛋白、Rab22a(Rab protein 22a,Rab22a)蛋白、肿瘤蛋白 p53 结合蛋白 2(Tumor protein p53 binding protein 2,TP53BP2)和TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1),这些蛋白参与细胞内的氧化还原反应、信号转导、生物调控、催化反应和蛋白定位等过程,在宿主细胞代谢中发挥作用,但具体的相互作用机理有待进一步研究。

2.1 NS4B与RPLP1相互作用 Zhang等[23]通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)试验、谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合蛋白沉降技术和共聚焦显微镜观察,发现RPLP1与CSFV NS4B蛋白相互作用,用慢病毒介导敲低RPLP1可抑制CSFV生长,过表达RPLP1可促进CSFV增殖,且CSFV感染会明显上调RPLP1的表达。RPLP1蛋白是60S 核糖体亚基的重要组成成分,负责协调翻译的延伸,可作为病毒粒子的受体蛋白参与病毒粒子的复制和组装等[24]。研究发现,核糖体蛋白 S25(Ribosomal protein S25,RPS25)在HCV内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry sites,IRES)介导的病毒蛋白的翻译中起促进作用,一旦RPS25耗尽,HCV的传播就会受损,而RPLP1对CSFV的IRES活性却没有影响[6]。进一步研究发现,在CSFV感染的第1个生命周期内,RPLP1会降低细胞内外子代病毒滴度和E2蛋白的表达,但不影响细胞内病毒基因组的复制和蛋白合成,推测RPLP1主要在CSFV基因组的翻译中起作用,其C端第66～114位氨基酸与NS4B蛋白相结合[13]。

2.2 NS4B与FHC相互作用 铁蛋白重链(Ferritin heavy chain,FHC)是一种铁蛋白,可将Fe2+转化为Fe3+,并降低细胞内产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,防止ROS的细胞毒性,此外,FHC还可介导细胞凋亡,促进核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的产生[25]。Qian等[26]研究发现,用慢病毒介导敲低FHC会抑制CSFV复制,过表达FHC会增强CSFV传播,且NS4B蛋白表达会上调FHC表达,进一步研究表明,FHC可促进CSFV增殖和抗细胞凋亡,但具体的作用机理有待进一步研究,且 FHC的抗凋亡作用依赖于其浓度,超过阈值时,其细胞毒性作用会抑制CSFV生长;而CSFV病毒滴度过高会扰乱FHC蛋白与CSFV之间的平衡,导致细胞发生铁死亡。

2.3 NS4B与Rab22a相互作用 Rab22a蛋白作为Ras相关GTP结合蛋白(Ras-related GTP-binding protein,Rab)家族成员之一,在囊泡转运过程中发挥调节作用[27]。刘雅茹[28]通过激光共聚焦、co-IP和GST pull-down试验证实了Rab22a与NS4B蛋白相互作用,干扰细胞Rab22a会显著抑制 CSFV的复制过程,过表达Rab22a则会促进CSFV的复制和增殖;对 Rab22a 进行突变也能抑制CSFV的复制和增殖,进一步证明了Rab22a对CSFV复制的促进作用。CSFV作为囊膜病毒,在感染早期可通过细胞内吞作用入侵细胞,并在多种转运蛋白的作用下运送至复制靶点进行病毒的复制和增殖,而 Rab5蛋白和Rab7蛋白是CSFV在入侵宿主细胞后,病毒从早期内体演变为晚期内体的关键因子[29],病毒入侵后先形成早期内体,后形成晚期内体,在细胞内环境pH发生变化后发生囊膜融合,最后病毒暴露核酸进行增殖[30]。有研究报道显示,Rab22a-Rab5-NS4B的相互结合可促进CSFV的复制,但具体机理仍有待进一步研究[31]。

2.4 NS4B与FASN相互作用 有研究表明,CSFV膜结构的形成需要脂肪酸的生物合成,该过程受脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)的调节,而CSFV NS4B蛋白在细胞内质网和高尔基体膜网的组装中发挥重要作用[32]。Liu等[33]研究发现,脂肪酸合成途径中的2种限速酶会影响CSFV复制,FASN抑制剂会破坏CSFV的复制,但不影响病毒的内吞,表明FASN对CSFV的积极作用;进一步研究发现,过表达NS4B蛋白会导致与NS4B相互作用的FASN上调,其相互作用位置主要在内质网;脂滴(Lipid droplets,LDs)上的Rab18可通过与NS4B蛋白相互作用调节NS4B与FASN的作用,进一步增加LDs的数量,促进CSFV的复制。

2.5 NS4B与MAVS相互作用 在识别CSFV感染的过程中,各种模型识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)在宿主的先天免疫系统中发挥重要作用,CSFV可以被维甲酸诱导基因蛋白I样受体[The retinoid acid-inducible gene-I (RIG-I) like receptors,RLRs]识别,并与MAVS蛋白结合,激活免疫反应[34]。Dong 等[35]研究发现,CSFV感染可导致猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)中MAVS表达增加,MAVS可增强抗病毒和促炎细胞因子的诱导和细胞凋亡,并可抑制CSFV的复制;但CSFV Npro蛋白可抑制MAVS诱导的干扰素和促炎细胞因子的释放以及细胞凋亡,且IRF3敲低也可抑制MAVS诱导的宿主细胞防御,表明Npro蛋白能通过降解IRF3来抑制MAVS介导的宿主细胞防御。Dong等[36]研究发现,CSFV NS4B蛋白可与MAVS相互作用,NS4B的表达不影响 MAVS 的表达,但会抑制MAVS介导的NF-κB活化和IRF3表达,从而抑制IL-8表达,表现出和Npro蛋白相似的作用。

2.6 NS4B与Tsg101相互作用 研究证实,内吞体分选转运复合体(Endocytic sorting complex required for transport,ESCRT)参与CSFV的入侵和排出[37]。Liu等[38]研究发现,ESCRT-I蛋白中的肿瘤易感基因 101(Tumor susceptibility gene 101,Tsg101)蛋白可协助CSFV从晚期内体Rab7和Rab9向溶酶体运输,并通过形成NS4B-NS5B-Tsg101复合物调节CSFV的复制。

2.7 NS4B与pRNF114相互作用 RING 结构域 E3 连接酶 (RING domain E3 ligases,RING E3s) 是一组包含 RING 指结构域的 E3 连接酶,可参与宿主免疫反应,抑制病毒复制[39]。Zhang等[40]筛选到1种RING E3 连接酶,即猪指环蛋白114(Porcine RING finger protein 114,pRNF114),并发现该蛋白C末端结构域可与CSFV NS4B蛋白相互作用,通过蛋白酶体依赖的途径导致K27连接的多泛素化和NS4B蛋白的降解,从而抑制CSFV的复制,但pRNF114的抗病毒作用取决于E3连接酶的活性。

3 小结与展望

CSFV NS4B蛋白与宿主蛋白Tsg101、Rab22a和FASN相互作用,参与病毒粒子内吞、释放和膜网结构形成,促进病毒复制;与宿主蛋白RPLP1相互作用,介导病毒粒子的翻译过程;与宿主蛋白MAVS和FHC相互作用,参与病毒的免疫逃避;与宿主蛋白pRNF114相互作用,抑制病毒的复制。此外,CSFV NS4B蛋白结构特定的氨基酸取代还会影响病毒的活力和毒力,可见其对CSFV生命周期的影响作用极大。非构蛋白NS4B还存在很多蛋白相互作用模式,如DV NS4B蛋白可与人工抑制剂相互作用,导致NS3-NS4B复合物形成受阻,从而抑制NS4B蛋白的复制过程[41];DV NS4B蛋白可与NS2B-NS3蛋白酶解旋酶结合促进病毒复制,可与NS5相互作用逃避宿主免疫反应[42]。Zou等[43]研究发现,DV NS4A-NS4B相互作用所需的最小区域为NS4A氨基酸第40～76位和NS4B氨基酸第84～146位,表明非结构蛋白NS4B不仅可与宿主蛋白相互作用,还可与自身的结构蛋白或非结构蛋白,如DDX39B、COX7C、NR2F6、PSMC4、FGL2、MKRN1、RPL15、RPS3、TP53BP2和TBK1蛋白等相互作用,但CSFV的这种相互作用模式报道较少,还有待进一步验证和研究[44,45]。进一步阐明CSFV NS4B蛋白复杂的相互作用网络可以在一定程度上解释CSFV的复制机理和致病机理,为抗病毒策略制定、疫苗研究和新药开发提供理论依据。