致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定和致病性试验

张 红,田秋丰,王志强,黄宇翔,邹 跃,吕明哲,杨昊天,马志刚,霍明东,董佳强,杨 坤,魏念冬,苗 艳,钟 鹏,陈志峰

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院,黑龙江 齐齐哈尔 161005)

星状病毒(Astrovirus,AstV)为单股正链无囊膜结构的RNA病毒。目前,星状病毒科(Astroviridae)可分为2个属,即哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属。哺乳动物星状病毒属感染的宿主包括人类和一些哺乳动物,禽星状病毒属感染的宿主包括鸡、火鸡、鸭、鹅和其他鸟类[1]。AstV具有高度的遗传多样性和基因重组潜力,因此存在跨物种传播的可能性[2,3]。鹅感染星状病毒后主要引起雏鹅心脏、肝脏和肾脏尿酸盐沉积,导致痛风、跛行、生产性能下降甚至死亡[4,5]。该病的发病地域非常广泛,给养鹅业造成巨大的经济损失[6,7]。本试验以黑龙江省齐齐哈尔市某鹅场内发生雏鹅痛风的病死雏鹅为研究对象,进行病原分离、病毒株传代培养、PCR扩增、基因序列分析和动物回归试验,试验结果可为鹅星状病毒(Goose astrovirus,GoAstV)的进一步深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2019年5月,黑龙江省齐齐哈尔市某鹅场养殖10 000只雏鹅,于5日龄开始发病,13日龄死亡雏鹅数量达到2 000只,低温送检10只具有痛风症状的病死雏鹅,无菌采集病死雏鹅的脾脏、肝脏和肾脏,放入-80 ℃保存备用。

1.1.2 试验动物 12胚龄健康鹅胚和1日龄健康雏鹅,均购自齐齐哈尔山海养殖专业合作社,经检测,GoAstV、小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、鹅副黏病毒(Goose paramyxoviru,GPMV)、禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)和坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)抗原均为阴性。

1.1.3 主要试剂 病毒DNA/RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒,均购自天根生化科技(北京)有限公司;反转录试剂盒、Premix PrimeSTAR HS、pMDTM19-T载体、PCR产物快速连接试剂盒和DNA Marker(DL2 000),均购自宝生物工程(大连)有限公司;DH5α感受态细胞,购自上海唯地生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器 基因扩增仪(T30,杭州朗基科学仪器有限公司);微型高速离心机(MiniSpan Plus,杭州奥盛仪器有限公司);干式恒温器(MK-20,杭州奥盛仪器有限公司);恒温水槽(DK-8D,上海一恒科学仪器有限公司);全自动多功能孵化机(D247,德州富民孵化设备研制中心);电热恒温培养箱(DH-4000Ⅱ型,天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 将采集的肝脏、脾脏和肾脏组织病料放入研钵中,按组织重量与生理盐水1∶5加入0.9%生理盐水,一边加入生理盐水一边充分研磨,制备悬液,反复冻融3次,8 000 r/min离心10 min,取上清于干净的EP管中。用0.22 μm滤器对上清液进行过滤除菌,并经尿囊膜接种于12日龄鹅胚,接种剂量为0.3 mL/枚,共接种6枚。置38 ℃孵育,每日观察鹅胚死亡情况,弃去24 h内死亡鹅胚,收集168 h内死亡鹅胚的尿囊液和胚体。

1.2.2 引物设计 根据GenBank中已发表GoAstV毒株HLJ01全基因序列(登录号为MN175321),使用Oligo7.0和Primer Premier 5.0软件设计3对引物,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表1。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer details

1.2.3 PCR扩增 将收集到的死亡鹅胚尿囊液,按照病毒DNA/RNA抽提试剂盒说明书操作,抽提尿囊液的总DNA/RNA,按照反转录试剂盒说明书操作将RNA反转录为cDNA。用抽提的DNA或反转录的cDNA为模板,分别进行GoAstV、GPV、GPMV、TMUV和FAdV的PCR检测。GoAstV反应体系(50 μL):2×Master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,超纯水补足至50 μL。反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,53 ℃(GoAstVORF2-1)、55 ℃(GoAstVORF2-2)和57 ℃(GoAstVORF2-3)退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;最后72 ℃延伸5 min。GPV、GPMV、TMUV和FADV的PCR检测方法参照参考文献[8-10],PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 PCR产物序列测定和分析 PCR产物胶回收后连接pMD19TM-T载体,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序所得结果拼接,将所得序列在NCBI网站上进行Blast同源性比对,与GenBank已发布的其他不同种属星状病毒进行同源性分析,运用MEGA 7.0软件和邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树。

1.2.5 动物回归试验 将30只1日龄健康雏鹅随机分成2个组,试验组20只,对照组10只,隔离饲养。试验组皮下接种纯化后毒株的F3代尿囊液,1.0 mL/只,对照组接种相同剂量的无菌生理盐水。每日观察并记录2个组雏鹅的发病和死亡情况。对接种后发病死亡的雏鹅进行及时剖检,观察各组织脏器和关节等处的病理变化。

2 结果

2.1 病毒分离 将疑似感染GoAstV病鹅的组织研磨滤液接种鹅胚,其在鹅胚上可以稳定传代,连传3代,鹅胚集中在72～168 h死亡,死亡率约达90%,死亡鹅胚尿囊膜增厚并有尿酸盐沉积,胚体严重充血、水肿、呈潮红色(图1)。

图1 死亡鹅胚的胚体变化Fig.1 Embryo body changes in dead goose embryosA:胚体充血、水肿、呈潮红色; B:尿囊膜增厚A:Embryonic congestion, edema and appearing bright-red; B:Thickening of the allantoic membrane

2.2 PCR扩增 结果显示,仅GoAstV为阳性,GPV、GPMV、TMUV和FAdV均为阴性。分离毒株在约600、700和800 bp处出现与预期大小一致的目的条带(图2),表明分离病毒为GoAstV,命名为Goose Astrovirus/Heilongjiang/QS1/2022株(简称QS1株)。

图2 分离毒株的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of the isolated strainsM:DL-2 000 DNA 相对分子质量标准; 1～3:鹅星状病毒; 4:小鹅瘟病毒; 5:鹅副黏病毒; 6:坦布苏病毒;7:禽腺病毒; 8:阴性对照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-3:GoAstV; 4:GPV; 5:GPMV;6:TMUV; 7:FAdV; 8:Negative control

2.3 PCR产物序列测定和分析 将分离毒株QS1的基因序列测序结果与GenBank上已发表的其他星状病毒的核苷酸序列进行同源性比较,结果显示,分离毒株QS1与近年来报道引起痛风的新型GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1的核苷酸同源性较高,达99.58%～99.72%。系统进化树如图3所示,分离毒株QS1与同源性较高的GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1在同一分支上;与其他GoAstV毒株FLX、AHDY和SCCD处于同一进化分支中不同的进化亚分支;与鸭源星状病毒遗传距离较远。由此可见,导致该鹅场出现鹅痛风的星状病毒为GoAstV 2型。

图3 分离毒株QS1与其他星状病毒的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of isolated QS1 strain and other AstV strains▲:本试验分离毒株QS1▲:QS1 strain isolated in this study

2.4 动物回归试验 试验组雏鹅接种分离毒株F3代尿囊液48 h后出现临床症状,表现为精神沉郁,食欲不振,呆立;72 h后开始出现死亡,死亡率为70%,发病率为100%。病死雏鹅及时剖检可见心脏、肝脏表面有大量尿酸盐沉积;肾脏明显肿大,表面偶有尿酸盐沉积,输尿管变粗,内有大量白色石灰样沉淀物;胆囊肿大,颜色变浅,内有白色石灰样结晶颗粒;剖开腕关节可见白色石灰样沉积物(图4)。试验组未死亡雏鹅比对照组雏鹅明显消瘦。对照组雏鹅未见明显临床症状,无死亡。

图4 病死雏鹅剖检观察Fig.4 Autopsy observation of dead goslingsA:腕关节处有石灰样尿酸盐沉积; B:整个心脏、部分肝脏表面有石灰样尿酸盐沉积; C:肾脏肿胀,输尿管变粗,内有大量石灰样尿酸盐沉积; D:胆囊肿大,内有石灰样结晶颗粒A: Lime-like urate deposits at the wrist joint; B: Lime-like urate deposits on the entire surface of the heart and part of the liver; C: Swollen kidneys, dilated ureters with abundant lime-like urate deposits; D: Enlarged gallbladder with lime-like crystalline particles inside

3 讨论

禽星状病毒已被证明在家禽中与腹泻、生长抑制、肾炎和肠炎有关[11]。自2016年以来,我国各地均有报道以雏鹅发生痛风为特征的病例[12,13],鹅感染AstV后主要引起雏鹅心脏、肝脏和肾脏尿酸盐沉积,导致痛风、跛行、生产性能下降,给养鹅业造成巨大的经济损失。

本试验分离鉴定的QS1株经系统发育进化树分析结果显示,分离毒株QS1属于禽星状病毒的1个新毒株,与近年来报道引起痛风的新型GoAstV的核苷酸同源性最高。致病性试验结果显示,QS1感染雏鹅后发病率为100%,死亡率为70%,属于强毒株。而Zhang等[14]从具有痛风症状的雏鹅中分离鉴定出1种新型GoAstV,致病性试验表明,所有感染的雏鹅在感染后2周内均存活。这与本致病性试验结果截然不同,可能与感染途径、剂量和年龄存在差异有关。

有报道显示,感染GoAstV死亡雏鹅的肾小管内存在蛋白物质,表明GoAstV可以导致肾组织上皮细胞通透性增强,肾小管上皮细胞发生变性、坏死,导致雏鹅肾脏功能损伤[15-17]。本试验剖检试验组雏鹅时,可见输尿管内有大量的尿酸盐沉积。严重的尿酸沉积可能会阻塞肾小管,造成肾组织损伤,从而减少尿酸排泄,使血液中尿酸含量增加[18,19]。尿酸通过血液循环转移至身体的各个器官,因此,心脏、肝脏和肾脏等血液灌注量大的器官,痛风病变更为明显。本试验结果与Zhang等[20]和Yin等[21]报道的结果基本一致,由此可见,GoAstV感染引起的雏鹅肾脏损伤可能是导致雏鹅痛风的主要原因。

AstV全基因组均包含3个开放阅读框(Open reading frame,ORF),分别为ORF1a、ORF1b和ORF2。ORF1a和ORF1b基因编码非结构蛋白;ORF2基因编码衣壳蛋白的前体结构蛋白,在蛋白水解成熟、病毒传染性、病毒与宿主抗体和补体相互作用及病毒入侵宿主细胞中发挥重要作用[22,23]。本试验为将ORF2基因成功扩增,根据基因序列共设计3对引物,通过PCR扩增获得了分离毒株QS1的3段ORF2基因序列,为下一步表达相关蛋白和后续试验提供参考。

经GoAstV感染的雏鹅除痛风表现外,还会出现食欲不振或废绝,从而严重抑制生长[24,25],即使发病后未死亡雏鹅,其饲料转化率也会严重下降,造成生长缓慢,给鹅产业造成巨大的经济损失[26]。本试验发现,低温、高湿、通风条件差和饲养管理不到位是导致雏鹅发病率和死亡率高的主要原因,此外,饲料中的高蛋白水平是否会促进痛风的发生还需要进一步研究。目前,针对新型GoAstV引起的雏鹅痛风尚无有效的治疗措施,预防GoAstV也无商品化疫苗,因此预防GoAstV感染,应规范饲养管理、减少鹅应激和加强对鹅舍的消毒。对于发病的场区要严格消毒、严格隔离和严禁带毒鹅的流通扩散。加快灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研制,通过对鹅群免疫接种,获得免疫力和保护力是预防本病的有效手段。

本试验从黑龙江省齐齐哈尔市某鹅场采集具有痛风症状雏鹅的病变组织,通过鹅胚分离、PCR扩增、基因序列分析和动物回归试验证实鹅痛风病的致病原为GoAstV,命名为QS1株。遗传进化分析表明,该病毒分离株与近年来新型GoAstV分离株同源性较高,可引起雏鹅死亡,死亡率可达70%。本试验结果为后续GoAstV疫苗和诊断试剂的研制提供了原材料。