赤羽病病毒Gcaa465～704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

魏 方,陈冬杰,邓俊花,王晶晶,吴绍强

(中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所,北京 亦庄 100176)

赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)是引起反刍动物赤羽病 (Akabane disease,AKA) 的一种虫媒病毒,主要通过库蠓类吸血昆虫叮咬进行传播,广泛分布于温带和热带地区,包括澳大利亚、亚洲和非洲等地区。该病毒于1959年在日本群马县捕获的蚊子中首次分离获得[1]。反刍动物感染AKAV后可出现发热、腹泻、产奶量下降、流产死胎和新生牛羊先天性关节弯曲-积水性无脑综合征(Congenital arthrogryposis hydraencephaly syndrome,AH)等[2],对发病地区的牛羊养殖业产生了严重危害。

AKAV属于布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛布血清群(Simbu serogroup),是一种包膜病毒,含有3段负义单链RNA,即S、M和L;编码6种蛋白,包括糖蛋白Gn和Gc、核衣壳蛋白N、非结构蛋白NSs和NSm以及RNA依赖性RNA聚合酶[3]。正布尼亚病毒属病毒的糖蛋白Gc是完整的跨膜蛋白,在病毒颗粒表面形成刺突,对病毒附着、膜融合和宿主免疫反应具有重要意义[4]。研究证明,Gc蛋白N端可变部分具有高免疫原性,是中和抗体的主要靶标[5]。为进一步研究Gc蛋白的生物学功能,本试验通过昆虫细胞杆状病毒系统表达AKAV Gcaa465～704蛋白,在此基础上利用杂交瘤技术制备针对Gcaa465～704蛋白的单克隆抗体,以期为研究AKAV Gc蛋白的功能提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 细胞和实验动物 昆虫卵巢细胞(SF21)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和乳仓鼠肾细胞(Baby hamster syrian kidney,BHK21),均由中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所保存;DH10Bac感受态细胞,购自北京博迈德基因技术有限公司。6～8周龄雌性BALB/c小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可证号:SCXK(京)2021—0006]。

1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒,购自全式金生物技术有限公司;转染试剂ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent,购自Thermo Fisher公司;SIM SF昆虫细胞培养基,购自Sino Biological公司;QuickAntibody-Mouse5W免疫佐剂和单抗亚类鉴定试剂盒,均购自北京博奥龙免疫技术有限公司;庆大霉素、卡那霉素、四环素、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside,X-Gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)、Anti-His Mouse mAb和HRP标记的Goat Anti-Mouse IgG,均购自北京索莱宝科技有限公司;FITC标记的山羊抗小鼠IgG,购自CST公司;Ni Sepharose 6 Fast Flow,购自GE Healthcare公司。

1.3 主要仪器 电热恒温培养箱,购自上海一恒科技有限公司;超声波细胞粉碎机,购自宁波新芝生物科技股份有限公司;蛋白电泳仪,购自BIO-RAD公司;FluorChem R 多功能成像分析系统,购自Proteinsimple公司;PCR仪、CO2培养箱和荧光显微镜,均购自Thermo Fisher公司。

1.4 重组杆粒的构建和鉴定 因AKAV Gc蛋白全长含跨膜区不易表达,故本试验选取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列[4],依据昆虫细胞偏好进行密码子优化后,由北京擎科生物技术有限公司合成至pFastBac HTB载体。将合成的重组质粒pFastBacHis-Gcaa465～704转化至DH10Bac感受态细胞,在37 ℃、200 r/min摇床中培养4 h。取适量菌液涂布至含庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-Gal和IPTG的LB平板上,倒置于37 ℃培养箱,经过连续2次蓝白斑筛选后,挑取白色单菌落于含庆大霉素、卡那霉素和四环素的LB培养基中扩大培养后,使用质粒提取试剂盒提取重组杆粒,利用通用引物M13F/R进行PCR鉴定,同时送北京擎科生物技术有限公司测序。将PCR鉴定为阳性且测序正确的重组杆粒命名为Bacmid-Gcaa465～704。

1.5 重组杆状病毒的拯救 按照转染试剂说明书操作,将重组杆粒Bacmid-Gcaa465～704转染至SF21昆虫细胞,置于28 ℃细胞培养箱培养约72 h,离心收集细胞培养上清,获得第1代重组杆状病毒液,即P1。用P1感染SF21昆虫细胞,28 ℃条件下培养72 h后,在显微镜下观察细胞形态,离心收集细胞培养上清,获得P2;以同样的方法获得第3代重组杆状病毒液P3。

1.6 重组AKAV Gcaa465～704蛋白的表达、鉴定和纯化 取适量P3重组杆状病毒液感染SF21昆虫细胞,28 ℃条件下悬浮培养72 h左右,分别收集细胞培养上清液和细胞。使用超声破碎仪破碎细胞,分别收集破碎后的上清液和沉淀。将细胞培养上清液、细胞破碎上清液和细胞破碎沉淀进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定,观察蛋白表达情况。然后用Ni亲和层析填料纯化重组AKAV Gcaa465～704蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE并转至NC膜,用5%脱脂乳4 ℃过夜封闭,分别以Anti-His Mouse mAb为一抗,HRP标记的Goat Anti-Mouse IgG为二抗,进行Western blot鉴定。

1.7 重组AKAV Gcaa465-704蛋白mAb的制备 参照QuickAntibody-Mouse5W免疫佐剂说明书,将佐剂与纯化的AKAV Gcaa465～704蛋白按体积比1∶1迅速混匀,免疫小鼠。参照参考文献[3]的方法筛选出能够稳定分泌抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb的杂交瘤细胞。

1.8 mAb特性的鉴定 将表达纯化的重组AKAV Gcaa465～704蛋白和重组施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)Gc蛋白进行SDS-PAGE并转至NC膜,用5%脱脂乳4 ℃过夜封闭,分别以筛选出的mAb杂交瘤细胞培养上清液为一抗,HRP标记的Goat Anti-Mouse IgG为二抗,进行Western blot鉴定。按照单抗亚类鉴定试剂盒说明书操作,对获得的mAb进行亚型鉴定。

将AKAV感染BHK21细胞,培养24 h后弃去培养基,使用预冷的无水乙醇固定细胞20 min,分别以筛选出的mAb杂交瘤细胞培养上清液为一抗,FITC标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA),在荧光显微镜下观察结果并拍照记录。

2 结果

2.1 重组杆粒的鉴定 对获得的重组杆粒进行PCR鉴定,结果显示,目的条带约位于3 000 bp处(图1),与预期大小一致,且测序结果正确,表明成功构建了AKAV-Gcaa465～704重组杆粒,将其命名为Bacmid-Gcaa465～704。

图1 Bacmid-Gcaa465～704的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Bacmid-Gcaa465-704M:DNA分子质量标准; 1:Bacmid-Gcaa465～704的扩增产物M:DNA molecular weight Marker; 1:Amplification product of Bacmid-Gcaa465-704

2.2 重组杆状病毒的拯救 用P1感染SF21昆虫细胞,培养72 h后,显微镜下观察可见,与正常SF21昆虫细胞(图2A)相比,感染的SF21昆虫细胞发生明显病变,即出现大量核胞体,细胞间隙增大,部分细胞变大失去光泽,甚至皱缩死亡(图2B)。

图2 显微镜观察SF21昆虫细胞形态Fig.2 Observation of SF21 insect cell morphology under microscopeA:正常的SF21昆虫细胞; B:P1感染的SF21昆虫细胞A:Normal SF21 insect cells; B:SF21 insect cells infected with P1

2.3 重组AKAV Gcaa465～704蛋白的表达、鉴定和纯化 P3感染SF21昆虫细胞72 h后的SDS-PAGE鉴定结果显示,在相对分子质量35 kDa处出现1条特异的染色条带(图3A),利用Ni亲和层析填料纯化,获得纯度达90%以上的目的蛋白(图3B)。

图3 重组AKAV Gcaa465～704蛋白的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鉴定Fig.3 Identification of recombinant AKAV Gcaa465-704 protein by SDS-PAGE (A) and Western blot (B) M:预染蛋白质分子质量标准; 1:P3感染的SF21昆虫细胞培养上清液; 2:P3感染的SF21昆虫细胞破碎上清液; 3:P3感染的SF21昆虫细胞破碎沉淀; 4:正常的SF21昆虫细胞; 5、6:纯化的AKAV Gcaa465～704蛋白M: Pre-stained protein molecular weight Marker; 1: Culture supernatant of SF21 insect cells infected with P3; 2: Lysis supernatant of SF21 insect cells infected with P3; 3: Lysis precipitate of SF21 insect cells infected with P3; 4: Normal SF21 insect cells; 5, 6: Purified AKAV Gcaa465-704 protein

2.4 mAb特性的鉴定 杂交瘤细胞经筛选和亚克隆后,获得1株稳定分泌抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb的细胞株4D1,mAb重链为IgG1亚型,轻链为Igк型。通过Western blot验证,mAb 4D1仅与AKAV Gcaa465～704蛋白反应,不与重组SBV Gc蛋白反应(图4),表明该单抗能够特异性识别AKAV Gcaa465～704蛋白。

图4 mAb 4D1的Western blot鉴定Fig.4 Western blot identification of mAb 4D11:AKAV Gcaa465～704蛋白; 2:SBV Gc蛋白1:AKAV Gcaa465-704protein; 2:SBV Gc protein

以mAb 4D1作为一抗进行IFA分析,AKAV感染的BHK21细胞出现特异性绿色荧光,而未感染的BHK21细胞没有出现绿色荧光(图5),表明mAb 4D1与AKAV感染的BHK21细胞发生特异性结合。

图5 mAb 4D1的IFA鉴定Fig.5 IFA identification of mAb 4D1A:AKAV感染的BHK21细胞; B:正常的BHK21细胞A:BHK21 cells infected with AKAV; B:Normal BHK21 cells

3 讨论

赤羽病作为一种可导致反刍动物繁殖障碍的虫媒疫病,给流行区域和国家造成巨大的经济损失。随着全球气候变暖和全球贸易往来日益频繁,该病传播范围逐渐扩大。相关研究人员已在我国部分地区的牛羊血清中检测出AKAV中和抗体[2]。近年来研究发现,辛布血清群病毒在流行区域呈现血清学和分子生物学检测技术是常用的病毒检测技术。对于成年反刍动物,病毒血症通常在出一种循环流行的现象,即病毒季节性高发后零星散发,这可能与宿主群体的整体免疫力和库蠓属昆虫载体的丰度有关[6]。考虑到赤羽病对畜牧产业产生的危害,做好该病的应对措施和相应检测技术储备具有重要意义。

AKAV感染后1～6 d发作,并仅能持续4～6 d[7],这导致直接病毒检测以及后续PCR检测和测序受到一定程度的限制。与之相比,抗辛布病毒抗体在感染后1～3周内能够被检测到,并且在感染动物体内持续存在长达2年之久[8,9],所以血清学检测特异性抗体是一种更受欢迎的诊断方法。已有研究报道,在全病毒抗原和重组N蛋白基础上建立的AKAV血清学检测方法,由于N蛋白相对保守使得不同辛布血清群病毒之间易发生交叉反应,且抗N蛋白抗体没有中和活性[10]。相反地,辛布血清群病毒Gc蛋白同源性较低[11],中和血清试验显示,抗糖蛋白中和抗体对特定病毒更具特异性[12]。Gc蛋白作为AKAV的中和抗原,一直受到研究人员的关注,研究发现,其至少含有5个不同的抗原区[13]。王建华等[14]建立了一种基于重组截短Gcaa407-614的AKAV抗体间接ELISA检测方法。Ogawa等[15]利用斑点印迹分析发现,Gcaa1-97和Gcaa189-397区域包含中和位点。此外,研究显示,正确的糖基化对Gc蛋白抗原性和免疫原性至关重要[16,17]。杆状病毒表达系统是以昆虫细胞为表达宿主建立的一种真核表达系统,能够对所表达的外源蛋白进行翻译后修饰,促进其正确折叠[18]。本试验通过昆虫细胞杆状病毒系统截断表达AKAV Gcaa465～704蛋白,将其纯化后免疫小鼠,制备了1株可稳定分泌抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb 的细胞株4D1,mAb重链为Ig G1亚型,轻链为Ig к型,能够特异性识别AKAV Gcaa465～704蛋白,且可与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。本试验表达的AKAV Gcaa465～704蛋白和制备的抗AKAV Gcaa465～704蛋白mAb 4D1为进一步研究开发AKAV诊断方法和分析Gc蛋白的功能提供技术支撑。