复方红豆杉胶囊与替莫唑胺对胶质瘤细胞的协同杀伤作用

张弛，王英 ，杨福义*

（1 佳木斯大学，佳木斯 154000；2 齐齐哈尔医学院附属第二医院，齐齐哈尔 161000；3 佳木斯大学院附属第一医院神经外科，佳木斯 154000）

脑胶质瘤是常见的颅脑恶性肿瘤，其约占所有类型的颅内肿瘤的50%，且发病率、复发率和死亡率一直居高不下[1]。由于替莫唑胺-烷化剂（temozolomide，TMZ）易穿透血脑屏障，已成为治疗脑胶质瘤最重要的药物[2]。但TMZ 也依然具有杀伤正常细胞、胃肠道反应和骨髓抑制以及耐药等副作用[3]。目前胶质瘤的联合治疗已经非常普遍，多种药物联合使用不仅可以有效控制患者体内肿瘤细胞的生长，还有助于抑制或改善的并发症，改善机体的耐药性[4,5]。复方红豆杉胶囊（compound taxus chinensis capsule, CTCC）具有强力杀伤肿瘤细胞，增强机体免疫系统，且治疗效果持久稳定、抗肿瘤谱广且不良反应较轻特点，目前已经用于如肺癌、直肠癌和胃癌等多种肿瘤的直接或辅助化疗中[6-8]。而在胶质瘤的化疗中，CTCC 与TMZ 是否具有协同作用并不清楚。因此，本研究以体外培养的U251 细胞为研究对象，初步分析了CTCC 和TMZ 对胶质瘤的化疗的影响。

材料与方法

1 主要试剂

TMZ（上海创赛科技有限公司）；CTCC（重庆赛诺生物药业股份有限公司），在使用时，去掉胶囊，用DMSO 溶解药粉；兔源一抗KI-67、PCNA、Bcl-2、Bax、细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和Cleaved Caspase-3 和普通ECL 化学发光检测试剂盒、Dylight 488 或Dylight 594 或HRP 标记的羊抗兔IgG（武汉三鹰生物技术有限公司）；RIPA 试剂、细胞质/核分离试剂盒、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、BSA-TBS 缓冲系统封闭液、Blotto A 封闭液、Western blot 专用一抗和二抗稀释液、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（武汉博士德生物科技有限公司）；细胞固定液（北京百瑞极生物科技有限公司）。

2 主要仪器

超净工作台（苏州净化设备有限公司）；DTY-2000 脱色摇床（北京德天佑科技发展有限公司）；DNM-9602A 酶标仪（北京普朗新技术有限公司）；IRX50 荧光显微镜（舜宇光学科技 （集团）有限公司）；EXFLOW 流式细胞仪（深圳市达科为生物技术股份有限公司）；化学发光成像及分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

3 细胞培养

将人神经胶质瘤U251 细胞购自广州赛业生物科技有限公司，将其置于含10%胎牛血清的低糖DMEM 培养基内，于37 ℃、5% CO2和饱和湿度的条件培养，待生长融合度达90%时，行1∶3 传代。

4 MTT 法筛选CTCC 和TMZ 对U251 细胞的作用浓度与实验分组

用不同浓度的CTCC 和TMZ 处理U251 细胞48 h 后，用MTT 法检测细胞活力，然后求出IC50值。实验步骤如下：

①CTCC 量效设计：0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL。

②TMZ 量效设计：0 μmol/L、10 μmol/L、25

μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L。

③将对数生长期的U251 细胞接种到96 孔板（1×104个/孔）中，于37℃细胞培养箱培养24 h，然后吸掉旧培养基，分别加入含不同浓度（0 mg/mL、

0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL）CTCC 和/ 或含不同浓度（0

μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L）TMZ 的DMEM培养液预处理细胞30 min，每组设置3 个复孔，同时设置校准孔、溶剂对照孔，再用新培养基培养48 h 后，弃去培养液，向每孔加入新鲜培养液及10 μL MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），在37℃孵育4 h，再加入100 μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在490 nm 的波长下，用酶标仪测量每个孔的OD 值，计算出IC50值。根据计算结果，CTCC 的IC50值的中位数1.796（95%CI：1.666～2.047）mg/ml，TMZ 的IC50值的中位数106.2（95%CI：83.98～153.1）μmol/L。为了后续实验简便，后续实验采用的CTCC 的浓度为2 mg/mL，CTCC 的浓度为100 μmol/L。将U251 细胞分为对照组、CTCC 处理组（2 mg/mL），TMZ 处理组（100 μmol/L），CTCC+TMZ 处理组，即除对照组外，分别用2 mg/ml CTCC 或/和100 μmol/L TMZ预处理细胞30 min。

5 MTT 检测各组细胞活力

将对数生长期的U251 细胞接种到96 孔板（1×104个/孔）中，于37 ℃细胞培养箱培养24 h，然后吸掉旧培养基，按照前述分组方法预处理细胞30 min，再培养48 h，用MTT 法检测细胞活力。细胞活力=（实验组OD 值-溶剂对照孔OD 值）/（对照组OD 值-溶剂对照孔OD 值）×100%。

6 集落形成实验检测各组细胞集落形成能力

将U251 细胞按照前述分组方法预处理细胞30 min，收集细胞并进行计数。12 孔板种板，每个孔中加入1000 个细胞，放入CO2培养箱常规培养7 d，根据细胞状态进行培养基的更换，弃掉培养基，用PBS 进行清洗2 次（注意清洗力度，一定要轻柔），于12 孔板内加入1 mL 细胞固定液，30 min，弃掉细胞固定液，用PBS 进行清洗2 次，于12 孔板内加入1 mL 0.1%结晶紫，3 min，弃掉结晶紫，用PBS进行清洗至孔板底部清洗，拍照计数。

7 JC-1 探针检测各组细胞线粒体去极化

将U251 细胞按照前述分组方法预处理细胞30 min，再培养48 h 后，收集细胞，并重悬于1 mL EP管内，加入0.5 mL JC-1 探针染色工作液37℃避光孵育30 min，流式细胞仪上进行检测。

8 Annexin V/PI 染色与TUNEL 染色检测各组细胞凋亡

将U251 细胞按照前述分组方法预处理细胞30 min，再培养48 h 后，再分别按Annexin V/PI 染色与TUNEL 染色法检测各组细胞凋亡。

Annexin V/PI 染色步骤：收集各组细胞，加入200 µL Annexin V-FITC 结合液，避光条件下，加入5 µL Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入10 µL PI 染色液，轻轻混匀，室温（22 ～25 ℃）孵育20 min，在流式细胞仪上进行检测。

TUNEL 染色步骤：用细胞固定液固定细胞1 h，PBS清洗以后，加0.1% Triton X-100通透细胞5 min，避光条件下，加入100 µL TUNEL 染色液，室温（22～25℃）孵育60 min，加入DAPI 染液3 min，荧光显微镜下观察。

9 免疫荧光观察各组细胞Ki-67 和PCNA 表达

将U251 细胞按照前述分组方法预处理细胞30 min，然后进行细胞爬片48 h。用细胞固定液固定细胞1 h，PBS 清洗以后，加0.1% Triton X-100通透细胞5 min，用5% BSA 封闭1 h，分别用Ki-67、PCNA 一抗（均1∶1000）37 ℃孵育2 h，PBS清洗后，分别孵育Dylight 488 或594 标记的羊抗兔IgG(H+L)二抗（均1∶1000），室温（22 ～25 ℃）孵育60 min，加入DAPI 染液3 min，荧光显微镜下观察。

10 Western blot 检测各组细胞Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax、Cyt C 和Cleaved Caspase-3 表达

将U251 细胞按照前述分组方法预处理细胞30 min，然后培养48 h。收集细胞，并按说明书方法，用RIPA 提取总蛋白，用细胞质/核分离试剂盒提取细胞质蛋白。取适量蛋白质样品（30 μg/样），进行SDS 变性10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白后停止电泳，取出凝胶，置于转膜专用的三明治夹中将凝胶中的蛋白质转移到PVDF 膜上形成印记。将膜置于Blotto A 中，室温密封2 h。分别加入Ki-67（1∶2000）、PCNA（1∶2000）、Bcl-2（1∶4000）、Bax（1∶1000）、Cyt C（1∶500）、Cleaved Caspase-3

（1∶1000）和GAPDH（1∶5000）单克隆抗体，4 ℃摇动孵育过夜。将膜置于1 ×TBST 溶液中，摇动漂洗5 min，共4 次。将膜置于含有HRP 标记羊抗兔IgG(H+L)二抗（1∶800）的Blotto A 中，室温摇动孵育1.5 h。将膜置于1 ×TBST 溶液中，摇动漂洗5 min，共4 次。ECL 法显像，用化学发光成像分析系统捕获膜并分析每个蛋白质带的光密度值。该方法计算每个样品的蛋白质波段光密度值和对应值GAPDH（内参）比值，得到校正后的蛋白质波段光密度值，以对照组为进行标准化，并绘制代表蛋白表达的柱状图。

11 统计学分析

使用SPSS 22.0 进行数据分析。结果表示为均值±标准差，多组之间均数的两两比较采用方差分析事后Tukey 成对检验。P＜0.05 表示有统计学差异。

结 果

1 CTCC 与TMZ 协同抑制胶质瘤细胞增殖

与对照组比较，其余3 组细胞的活力、集落形成能力以及Ki-67 和PCNA 表达均降低；且CTCC+TMZ处理组变化较CTCC处理组和TMZ处理组变化更为明显（图1）。

图1 CTCC 与TMZ 协同抑制胶质瘤细胞增殖。A，各组细胞活力的柱状图；B 和C，各组细胞集落（B）和集落计数的柱状图（C）；D 和E，各组Ki-67（D）和PCNA（E）代表性免疫荧光图；F—H，各组Ki-67 和PCNA 代表性Western blot 条带（F）以及Ki-67（G）和PCNA（H）相对表达量的柱状图。比例尺，20 μm。与对照组比较：*P＜0.05 ；与CTCC 组或TMZ 组比较：#P＜0.05；n=3Fig. 1 CTCC and TMZ synergistically inhibit glioma cell proliferation. A, histogram of cell viability in each group; B and C, cell colonies of each group (B) and histogram of colony counts (C); D and E, representative immunofluorescence images of Ki-67 (D) and PCNA (E) in each group; F to H,representative Western blot bands for Ki-67 and PCNA (F) and relative expression levels of Ki-67 (G) and PCNA (H) in each group. Scale bar, 20 μm.P＜0.05, compared with Control group; #P＜0.05, compared with CTCC group or TMZ group; n=3

2 CTCC 与TMZ 协同促进胶质瘤细胞凋亡

与对照组比较，其余3 组细胞的细胞凋亡比例、TUNEL 阳性率以及Cleaved Caspase-3 表达均增加；其中CTCC+TMZ 处理组变化较CTCC 处理组和TMZ 处理组变化更为明显（图2）。

图2 CTCC 与TMZ 协同促进胶质瘤细胞凋亡。A 和B，各组代表性TUNEL 染色图（A）以及TUNEL 阳性率的柱状图（B）。C，Western blot 检测各组Cleaved caspase-3 表达。D 和E，各组细胞凋亡的代表性流式细胞散点图（D）以及凋亡率的柱状图（E）。比例尺，200 μm。与对照组比较：*P＜0.05；与CTCC 组或TMZ 组比较：#P＜0.05；n=3Fig. 2 CTCC and TMZ synergistically promote glioma cell apoptosis. A and B, representative TUNEL staining images (A) and histogram of TUNEL positive rates (B) in each group. C, Western blot of the Cleaved caspase-3 expression of each group.D and E, representative flow cytometry scatter plots of apoptosis (D) and histogram of apoptosis rates (E) in each group. Scale bar, 200 μm. *P＜0.05, compared with Control group; #P＜0.05, compared with CTCC group or TMZ group; n=3

3 CTCC 与TMZ 对线粒体去极化/Bcl-2/Bax 机制的协同调控作用

与对照组比较，其余3 组细胞的Bcl-2 表达均降低，而线粒体去极化、Cyt C 释放和Bax 表达均增加；其中CTCC+TMZ 处理组变化较CTCC 处理组和TMZ 处理组变化更为明显（图3）。

图3 CTCC 与TMZ 对线粒体去极化/Bcl-2/Bax 机制的协同调控作用。A 和B，各组JC-1 染色的代表性流式细胞散点图（A）以及线粒体去极化率的柱状图（B）；C，Western blot 检测各组细胞质中Cyt C 表达；D—F，各组Bax 和Bcl-2 代表性Western blot 条带（D）以及Bax（E）和Bcl-2（F）相对表达量的柱状图。与对照组比较：*P＜0.05；与CTCC 组或TMZ 组比较：#P＜0.05；n=3Fig. 3 Synergistic regulation of CTCC and TMZ on mitochondrial depolarization /Bcl-2/Bax mechanism. A and B, representative flow cytometry scatter plots of JC-1 staining (A) and histogram of mitochondrial depolarization rates (B) in each group; C, Western blot of the expression of Cyt C in cytoplasm of each group; D to F, representative Western blot bands for Bax and Bcl-2 (D) and histogram of the relative expression levels of Bax (E) and Bcl-2 (F)in each group. *P＜0.05, compared with Control group; #P＜0.05, compared with CTCC group or TMZ group; n=3

讨 论

脑胶质瘤为临床脑肿瘤常见的恶性病变，具有较强侵袭性和病死率，患者预后不佳[1]。目前医疗技术尚无法实现脑胶质瘤完全治愈的效果，因此如何有效延长患者的生存期成为改善其预后的主要治疗方向[4,5]。TMZ 为烷化剂类化疗药物，机体正常生理酸碱度水平下其能够快速转化为5-咪唑-4-酰胺，可阻断肿瘤细胞的DNA 复制，且具有较高的血脑屏障通过率，对于颅内肿瘤治疗有较佳效果[2]。但随着TMZ 化疗周期的延长，部分脑胶质瘤患者对其产生的抵抗作用逐渐增强，疾病控制率不佳[3]。因此临床治疗中应积极寻求有效联合治疗药物，以进一步完善临床治疗方案，改善脑胶质瘤患者的化疗效果，改善患者预后。

CTCC 已在临床中用于多种肿瘤的治疗或辅助治疗[6-8]。近来研究还显示，CTCC 还能增加如GP（吉西他滨和顺铂）化疗方案对中晚期肺癌患者的疗效并增强免疫功能[9,10]，增加BEV（贝伐珠单抗）+TC（紫杉醇+卡铂）[11]或脂质体阿霉素[12]化疗方案对复发性卵巢癌患者疗效，等。但，CTCC 对TMZ在胶质瘤治疗中的作用并不清楚。因此，本研究以体外胶质瘤细胞模型探讨了CTCC和TMZ二者在胶质瘤细胞的化疗中是否具有协同作用，结果显示，相对于单用CTCC 或TMZ，二者联用在U251 细胞的抑增殖和促凋亡中效果更为显著，说明二者在抗胶质瘤中可能具有协同作用。本研究进一步探讨了产生上述结果的可能原因。线粒体途径机制在调控细胞增殖与命运的机制中占据着中心地位[13,14]。众多研究[13-15]显示，诱导线粒体去极化造成线粒体膜通透性改变，进而释放Cyt C，改变Bcl-2/Bax 表达，最终能抑制下游促增殖蛋白如PCNA 和Ki67 表达，而促进凋亡蛋白执行者Caspase 3 的活化。本研究显示，CTCC 和TMZ 二者联用能增加线粒体去极化、降低Bcl-2 并增加Bax 表达，且下游PCNA 和Ki67表达降低和Caspase 3 的剪切，说明CTCC 和TMZ对胶质瘤细胞的化疗协同作用至少与其促进线粒体凋亡途径有关。

综上所述，CTCC 和TMZ 在抑制胶质瘤细胞的增殖和促进细胞凋亡的中具有协同作用，其机制可能与其诱导线粒体凋亡途径有关。