姜黄素对热应激条件下蛋鸡性腺机能和Sirtuins 基因家族表达的影响

袁翠，林晓骏，陈俊宇，何宝仪，安立龙，吴江

（广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

高温环境是制约家禽生产的一个重要因素，高温可引起家禽的热应激，导致生长和代谢紊乱、免疫抑制及肉蛋品质下降、死淘率增加、饲料转化率降低等，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失[1,2]。而如今伴随全球温度升高和高密度集约化养殖而来的家禽热应激问题日趋严峻，尤其是热带和亚热带地区，家禽热应激事件愈加频繁。热应激（Heat stress，HS）是指机体对高温环境做出的一系列非特异性生理反应的总和[3]。目前，关于热应激对家禽生理功能的影响机理以及如何有效缓解热应激等问题，己经引起国内外学者们的高度重视。

姜黄素（Curcumin，Cur）是一种天然的低分子量植物酸性多酚类化合物，具有广泛生物活性以及医用价值，同时可作为色素或食品添加剂用于食品加工，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调血脂、保护神经等多种功效[4]。Sirtuins 是一类功能多样的去乙酰化酶，活跃程度与NAD＋的水平呈正相关，是代谢过程的重要调节因子。Sirtuins 基因家族在调控线粒体的生物生成和代谢调控过程中具有重要作用[5]。有关研究表明，在热应激下，Sirtuins 基因家族出现氧化损伤。Sirt1 和Sirt2 位于细胞核和细胞质中，Sirt3、Sirt4 和Sirt5 位于线粒体中，而Sirt6 和Sirt7 只在细胞核中被发现，其成员的生物学功能不尽相同[6]。对其进一步深入研究，不仅提供更多有关细胞生命过程调控的信息，还可为临床疾病的诊断及治疗提供依据。前期研究表明，姜黄素能够改变13 月龄罗曼粉蛋鸡卵巢组织形态结构，并显著上调Sirt1、Sirt2、Sirt3 基因的表达[7]。而当前姜黄素对热应激条件下鸡性腺中Sirtuins 家族其他成员的表达和调控鲜有研究。

因此，试验以30 周龄罗曼粉鸡为研究对象，研究了姜黄素对热应激条件下鸡卵巢和睾丸器官中Sirtuins 基因家族表达量的影响，为姜黄素和热应激对Sirtuins 基因家族在性腺的表达和功能的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

主要试剂有：姜黄素（购自西安金绿生物工程有限公司，≥95%）； Trizol 试剂（购自北京索莱宝科技有限公司）；100 bp DNA Marker[购自生工生物工程（上海）股份有限公司]；PCR mix（康为世纪公司产品）；琼脂糖（购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；EB 替代品（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品）；Trizol 总RNA 提取试剂盒【天根生化科技（北京）有限公司产品】。

主要仪器有：PCR 仪（T100 型，伯乐生命医学产品有限公司）、凝胶成像系统（Tanon1220 型，广州誉维生物科技仪器有限公司）、三恒电泳仪（DYCP-31DN+DYY-6C 型，北京市六一仪器厂）、实验室专用超纯净水机（LM-75G-D 型，重庆科迪实验仪器有限公司）、光学显微镜（CX31 型，上海山汉光电科技有限公司）。

1.2 试验设计及样品采集

选择42 只30 周龄、健康、体重相近的罗曼粉蛋鸡（购自广州喜迎珍禽养殖有限公司），公母各半，随机分为常温对照组（CK 组）、高温对照组（HC 组）、高温处理组（HT 组），每组公鸡和母鸡各7 只鸡。常温组和高温组饲喂基础饲粮，饲粮配方与实验室前期发表文章相同[8]。高温处理组参照实验室前期的研究结果[9]，即在基础饲粮中添加200 mg/kg 姜黄素。试验基础饲粮组成及营养成分见表1，营养标准参考罗曼粉蛋鸡管理手册（https://lohmann-breeders.com）。试验在2019 年5～6 月进行。常温组保持温度在（25±3）℃，高温组和高温处理组在常温的基础上采用循环高温，保持每天10:00～16:00 温度在（32±3）℃，使用除湿机等严格控制各组湿度处于65%～80%。试验第21 天屠宰42 只罗曼粉蛋鸡，取出各组卵巢和睾丸组织，存放于-80 ℃冰箱。

表1 基础饲粮的组成和营养成分 单位：%

1.3 卵巢和睾丸组织切片的制作及HE 染色

将每组的卵巢和睾丸修整为1 cm×1 cm×0.5 cm的组织块，置于Bouin 氏固定液中固定24 h。组织块固定后以流水冲洗12 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μ m，展片及摊片，37 ℃温箱烤干，制得切片；切片脱蜡至蒸馏水浸泡2min；苏木精染核10 min，1% 盐酸酒精分化20 s，流动自来水蓝化15 min；1%伊红染细胞质2 min；梯度乙醇脱、切片透明；中性树胶封固。

1.4 产蛋率及采精量的测定

试验期间以每组重复为单位，统计3 周各重复的平均产蛋率和采精量。

1.5 总RNA 提取及cDNA 合成

使用Trizol 法提总RNA， 反转录合成cDNA，PCR 扩增目的条带。PCR 体系：PCRMix 1μ L、ddH2O 8.4 μL、引物F 0.3 μL、引物R 0.3 μL、模板1.0 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、52 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸30 s、72 ℃延伸10 min、4 ℃保存。引物信息见表2，由生工生物工程有限公司合成。

表2 PCR引物序列

1.6 基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为100 V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察，目的基因存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。使用凝胶呈像系统拍下凝胶图片并观察电泳结果。

1.7 数据分析

使用ImageJ 软件对各DNA 荧光条带进行灰度分析，数据整合至Excel2019 软件，SPSS 26.0软件采用Duncan 方法进行多重比较显著性差异，结果以（平均数±标准差）表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 姜黄素对热应激蛋鸡繁殖性能的影响

结果见图1。由图1 可知，与常温对照组（CK组）相比，高温组（HC 组）鸡的产蛋率和采精量明显下降，差异显著（P＜0.05），说明高温环境会导致蛋鸡产生热应激，进而对鸡的卵巢和睾丸产生不良影响；从高温组（HC 组）和高温处理组（HT 组）对比可知，添加姜黄素后，鸡的产蛋率和采精量均显著增加（P＜0.05），说明姜黄素能在一定程度上缓解高温热应激对鸡卵巢和睾丸产生的不良影响。

图1 姜黄素对33周龄热应激蛋鸡繁殖性能的影响

2.2 姜黄素对热应激蛋鸡卵巢和睾丸组织形态的影响

结果见图2。由图2 可知，在光学显微镜下观察卵巢和睾丸切片，高温组（HC 组）和常温组（CK组）相比，高温组中（HC 组）卵巢组织结构松散，卵泡细胞明显减少，形成大量的空白，睾丸组织中曲细精管出现空泡化，细胞的数量明显减少，且分布紊乱，但高温处理组（HT 组）与高温组（HC组）相比，可看出卵泡内容物明显增多和着色点也有增加。睾丸组织中曲细精管未出现空泡化，且细胞数量明显增多，但仍少于常温组中的细胞。

图2 蛋鸡卵巢和睾丸组织切片HE染色图。标尺=50μm（详见附录彩图）

2.3 姜黄素对热应激蛋鸡卵巢中Sirtuins 基因家族表达

姜黄素对热应激蛋鸡卵巢中Sirtuins 基因家族表达的影响见图3。由图3 可知，与常温对照组（CK组）相比，高温条件下Sirtuins 基因家族各基因在鸡卵巢器官中表达量明显都比常温的表达量少，差异显著（P＜0.05)，说明在高温条件下，鸡发生热应激会产生不良影响。从高温对照组（HC 组）和高温处理组（HT 组）对比可知，Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt5 基因在热应激条件下使用姜黄素后，在鸡卵巢器官中表达量明显上升，且差异显著（P＜0.05）；Sirt4、Sirt6、Sirt7 基因在热应激下使用姜黄素后，在30 周龄鸡卵巢器官中表达量与HC 组相比差别不大。说明姜黄素能在一定程度上缓解高温热应激对鸡卵巢产生的不良影响。

图3 姜黄素对Sirtuins基因家族在33周龄热应激蛋鸡卵巢部表达量的影响

2.4 姜黄素对热应激蛋鸡睾丸中Sirtuins 基因家族表达的影响

姜黄素对热应激蛋鸡睾丸中Sirtuins 基因家族条件下表达的影响见图4。由图4 可知，高温组（HC组）中的Sirtuins 基因家族表达水平相对于常温组（CK 组）来说都有所下降，其中以Sirt4、Sirt5和Sirt7 下降幅度较大，与CK 组相比差异显著（P＜0.05）。说明热应激会影响鸡睾丸中Sirtuin基因家族的表达量，但对于Sirt1 基因表达影响是最小的。从高温处理组（HT）和高温组（HC）对比可知，添加了姜黄素的高温处理组（HT 组），Sirtuins 基因表达量均有上调，且Sirt1、Sirt2、Sirt3 基因的表达量比常温组（CK）的表达量还要高。与高温组（HC 组）相比，高温处理组（HT 组）的Sirt4和Sirt5差异显著（P＜0.05）。由此可以表明，姜黄素能有效地缓解热应激对睾丸中Sirtuins 基因家族表达量的影响，尤其是对Sirt4 和Sirt5 的影响更大。

图4 姜黄素对Sirtuins基因家族在33周龄热应激蛋鸡睾丸部表达量的影响

3 讨论

3.1 姜黄素对热应激蛋鸡卵巢及卵巢中Sirtuins基因家族的调节作用

卵巢是雌性动物生产的重要器官，卵巢的重量及卵泡数量反映卵巢发育的情况。热应激条件下蛋鸡卵巢组织卵泡的内容物增多,着色加深,卵泡壁增厚[8]。高文[10]研究发现在高温环境中蛋鸡的产蛋率、采食量和破损蛋率显著降低，姜黄素能有效缓解蛋鸡产蛋率和促进卵泡的发育。赵壮志等[11]的研究表明，饲粮中添加姜黄素可以改善罗曼粉壳蛋鸡的卵泡发育。相关研究也表明了姜黄素显著上调卵巢组织细胞骨架调节和黏着连接、Nod 样受体信号通路、ErbB 和FoxO 信号通路的相关circRNA 表达谱[12]。Sirtuins 在维持卵巢储备、调控卵母细胞减数分裂、改善胚胎发育等方面具有重要功能[13]。相关研究表明，Sirt1 基因可缓解卵巢组织中细胞的衰老和凋亡，且抑制氧化凋亡情况下卵巢细胞自噬[14,15]。Sirt2 作为一种高度保守的组蛋白去乙酰化酶，可调控细胞增殖、细胞凋亡及氧化应激等多种生物学过程[16]；Sirt2 的表达可增强颗粒细胞糖酵解速率以改善大鼠卵泡发育[17,18]。Sirt3 在线粒体的适应性反应中起调节作用，包括对代谢程序的重排、提高抗氧化剂的保护作用等[19]。Sirt5 可通过调控Nrf2/HO-1 通路抑制ROS 依赖的DNA 损伤导致卵巢癌顺铂耐药[20]。

在试验中，Sirtuins 基因家族各基因在高温条件下在30 周龄鸡卵巢器官中表达水平显著低于常温组（CK 组）。添加姜黄素高温处理组的Sirtuins 基因家族表达水平均高于高温组，且Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt5 基因表达差异显著。可见高温条件能够抑制蛋鸡机体抗氧化和凋亡相关基因表达，对鸡机体产生不良反应。而姜黄素能在蛋鸡热应激条件下显著上调部分基因的表达水平来达到抑制细胞凋亡的效果，从而减少高温对卵巢产生的不良影响。

3.2 姜黄素对热应激蛋鸡睾丸及睾丸中Sirtuins基因家族的调节作用

精液量和睾丸的组织形态学是反映雄性动物繁殖力的重要指标。大量研究表明热应激会引起小鼠精子密度和质量损伤[21]。秦芹等[22]人研究发现高温使雄性大鼠睾丸的生殖腺组织萎缩，生精环境发生改变，阻碍了精子的发生和发育。姜志洋[23]发现添加姜黄素，高温下睾丸组织曲细精管的空腔状有所缓解，生精细胞增多，排列地更加密集有序，曲细精管间的间质细胞也明显增多。李佳滨[24]研究发现姜黄素对甲醛诱导的小鼠睾丸组织损伤具有保护作用。杨金凤[25]研究表明姜黄素可改善环磷酰胺所致生殖损伤，保护小鼠生殖功能。王志和牛艳峰[26]研究发现，饲粮中添加200 mg/kg 姜黄素能够显著提高热应激蛋鸡的抗氧化性能，提高生产性能。相关研究表明，Sirtuins家族在睾丸组织中有高表达，在调控精子发生过程中起重要作用[27]。其中，Sirt4 具有ADP 核糖基转移酶活性，是一种高度保守的蛋白，且被认为与脂代谢密切相关[28]。Sirt5 被认为能够有效去除赖氨酸羧基修饰[29]，王利红等[30]的试验结果也表明Sirt5 在同为哺乳动物的苏姜猪各部位广泛表达。Sirt7 基因的功能主要与各脏器功能细胞的物质能量代谢和分泌功能有关，表达也呈现广泛性[30-31]。

在试验中，高温组的Sirt4、Sirt5、Sirt7 表达水平显著低于常温组。添加姜黄素高温处理组的Sirtuins 基因家族表达水平均高于高温组，其中处理组的Sirt4 和Sirt5 表达水平与高温组差异显著。本试验结果表明，热应激条件下睾丸条件损伤可能与代谢及去除赖氨酸羧基修饰相关，结合相关研究成果，姜黄素通过上调Sirt4、Sirt5 的表达水平提高动物在热应激条件下的代谢效率来降低热应激对睾丸的损伤。

4 结论

高温下产生的热应激反应会不同程度地影响到鸡卵巢和睾丸及Sirtuins 基因家族的表达，姜黄素能在一定程度上缓解在热应激条件下30 周龄鸡性腺器官中Sirtuins 基因家族表达量的影响。