壳聚糖-大豆蛋白-百里香酚乳液制备及其对大口黑鲈保鲜效果

王世哲，黄 琪，凌玉钊，刘 斌，谭宏渊，乔 宇，汪 兰，熊光权，汪 超

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064)

自然界中含有大量大分子食源性蛋白、多糖及食品级的胶体颗粒，如纤维素[1]、淀粉[2]、蛋白质[3]、脂质[4]等，均具有成本低、无毒、成膜性好等特点，常常应用于可食膜的基质。目前多利用蛋白质与多糖[5,6]、多糖与多糖[7]之间的相互作用来制备固体颗粒稳定乳液。袁杨等[8]通过控制不同的pH 值、复合比、温度和离子强度，发现大豆蛋白和壳聚糖形成的复合水溶液体系稳定性极佳。孙颖恩等[9]利用大豆蛋白-壳聚糖凝聚物制备微藻油乳液，改善了微藻油乳液的物理稳定性及氧化稳定性。王柏琪等[10]发现壳聚糖与酯化大豆蛋白形成的复合物具有较好的乳化性和抗菌性。综上，以大豆分离蛋白与壳聚糖为基质形成的复合乳液具有优异的稳定性、乳化性及抑菌性。

大豆分离蛋白，简称大豆蛋白，是天然大分子，营养价值很高，自身具有的双亲性结构使其作为乳化剂能够扩散吸附在油-水界面[11]。百里香酚是疏水性酚类物质，其抑菌活性优于香芹酚、丁香酚等其他植物精油[12,13]。研究发现，百里香酚在非热条件下可促进大豆蛋白形成凝胶结构[14]，大豆蛋白加入后，蛋白质与多糖的相互作用及大豆蛋白与百里香酚形成的凝胶结构均影响乳液的稳定性[15,16]。目前，基于壳聚糖与大豆蛋白分子间相互作用及壳聚糖与百里香酚的协同抗菌作用[17]，将CST 乳液应用于水产品保鲜具有一定的现实意义，且鲜见将壳聚糖、大豆蛋白与百里香酚三者制成乳液用于水产品保鲜方面的研究报道。本研究通过控制大豆蛋白的添加量，构建多糖-蛋白质复合体系，通过壳聚糖与大豆蛋白分子间相互作用改善百里香酚表面活性，制成不同大豆蛋白浓度的壳聚糖-大豆蛋白-百里香酚（CST）复合乳液，研究其乳化活性指数、乳化稳定性指数、乳析指数等的变化。

大口黑鲈（Micropterus salmoides）是我国重要的饲养鱼之一，且大口黑鲈的预制菜市场很大[18]。目前冷链物流行业运输过程中贮藏温度多为10 ℃左右，因此本研究将经最佳配比CST乳液处理后的鲈鱼肉块与对照组在10 ℃下贮藏，检测鱼肉的pH、挥发性盐基氮和菌落总数，验证乳液保鲜效果，以期为新型乳化剂在水产品保鲜中的应用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

1.1.1 主要试剂 百里香酚（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司；大豆分离蛋白、8-苯胺-1-萘磺酸溶液（ANS），上海源叶生物科技有限公司；大豆油，食品级，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；壳聚糖（脱乙酰度80.0%～95.0%），购自国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂，青岛海博生物技术有限公司；氨水（体积分数20%，分析纯），上海阿拉丁生化科技有限公司。考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要仪器 K9840型自动凯氏定氮仪（海能未来技术集团股份有限公司）；Zetasizer Nano-ZS 型电位分析仪（英国马尔文公司）；Mastersizer2000 激光粒度分析仪（英国马尔文公司）；Flavour Spe GCIMS 联用仪1H1-00053（德国G.A.S 公司）；尼康YS100生物显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）。

1.1.3 主要材料 鲜活大口黑鲈（M.salmoides）购于湖北省武汉市洪山区武商量贩超市，1 h内运至实验室待用。

1.2 方法

1.2.1 CST 乳液的制备 1 g 壳聚糖加入到100 mL体积分数1%乙酸溶液。将2 g 百里香酚加到体积分数2% 100 mL 吐温-80 溶液，放入45 ℃恒温水浴锅中搅拌至充分溶解。将上述制备的两个溶液按照体积比1∶1 混合，得到含有质量分数0.5%壳聚糖、质量分数1.0%百里香酚的混合液，将其置于45 ℃磁力搅拌水浴锅保温。加入4 g 大豆蛋白，待大豆蛋白全部溶解后，再加入50 mL大豆油（SBO），将溶液冷却至室温后，以18 000 r/min 转速均质3 min，得到大豆蛋白质量分数为1.6%的CST 乳液。按照上述方法依次加入6、8、10、12 g 大豆蛋白制备质量分数2.4%、3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白添加量的CST乳液。

1.2.2 CST 乳液乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）的测定 EAI（m2/g）和ESI（%）参考Gao等[19]和Zhang等[20]方法。

1.2.3 CST乳析稳定性的测定 乳析指数（CI，%）参考Zhang等[20]方法。

1.2.4 CST乳液物理稳定性的测定 物理稳定性KE（%）参考Hu等[21]方法。

1.2.5 CST 乳液蛋白溶解度的测定 蛋白溶解度（%）参考Zhang等[20]方法。

1.2.6 CST 乳液表面疏水性的测定 表面疏水性参考Kato 等[22]并略作修改。将乳液以8 000 r/min 离心30 min，取50 μL 蛋白质上清液用去离子水稀释至5 mL，将蛋白溶液稀释到五个不同浓度梯度（0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL），在溶液中各加入40 μL 8 mmol/L ANS 溶液，使用荧光分光光度计测定荧光强度。以荧光强度对蛋白质量浓度作图并得到线性回归方程，初始段斜率值即为表面疏水性。

1.2.7 CST 乳液粒径、电位的测定 粒径、电位参考Chen 等[23]并略作修改。使用激光粒度分析仪测定乳液的粒度。使用去离子水将乳液稀释1 000 倍，然后装入DTS1070 毛细管比色杯，在电位分析仪测定乳液的Zeta 电位。分散相和连续相的折射率分别设置为1.475和1.330。

1.2.8 CST乳液浊度分析 浊度参考Hu等[21]方法。

1.2.9 紫外吸收光谱分析 紫外吸收光谱参考Yan等[24]方法。

1.2.10 CST 乳液美拉德反应物生成指数分析 美拉德反应物生成指数参考Yu 等[25]并略作修改。用去离子水将乳液稀释400 倍，分别测定其在294 nm和420 nm波长处光密度D294nm、D420nm。

1.2.11 内源荧光光谱分析 内源荧光光谱参考Yan等[24]并略作修改。将乳液稀释成蛋白质量浓度为0.2 mg/mL 的待测液，然后在荧光分光光度计扫描其荧光强度。程序参数为：激发波长280 nm，发射波长280～400 nm，激发和发射狭缝宽分别为5 nm和1 nm，扫描频率为1 200 nm/min。重复扫描5次。

1.2.12 CST 乳液的微观结构观察 参考Gao 等[19]的方法。

1.3 原料处理及指标测定

大口黑鲈，体长（33.0±2.0）cm，去头、尾、鳞，取背部肌肉切分成小块（平均质量约为50 g）。将切分的鱼肉块放入最佳配比的乳液中，鱼肉与浸泡液质量比为1∶2，浸泡时间为30 min。用中速滤纸吸干鱼片表面残留的浸泡液，然后将鱼块放入蒸煮袋并进行真空封装。将制备好的样品放入10 ℃恒温箱每天取样。在贮藏期间测定样品的总挥发性盐基氮（TVB-N）含量、菌落总数（TVC）、pH指标，具体参考GB5009.228—2016并略作修改，以去离子水作为试剂空白组。

1.4 数据处理

实验均进行三次重复，实验数据以平均值±标准差表示。使用统计分析软件SPSS 19.0 通过Duncan 多重极差检验在显著性水平（P＜0.05）上确定样品间的差异，用视化软件Origin 9.4绘图。

2 结果与讨论

2.1 大豆蛋白添加量对CST乳液乳化性的影响

图1 可以看出，添加质量分数3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白的CST 乳液EAI较大，且三者之间差异不显著（P＞0.05）。各浓度下ESI 变化不显著（P＞0.05）。添加质量分数3.2%大豆蛋白的CST 乳液乳液EAI 和ESI 最大，为（8.85 ± 0.13）m2/g 和（0.92±0.18）%。随着大豆蛋白含量升高，大豆蛋白与溶液中壳聚糖的亲水基团充分接触，使蛋白质的疏水基团暴露，增加了蛋白质的疏水性，蛋白质的疏水-亲水平衡得到改善，从而使乳液稳定性提高。同时，大豆蛋白与壳聚糖相互作用使其电荷增多，黏度增加，导致乳液乳化性增强[26]。在大豆蛋白低浓度时，壳聚糖含量高，乳液黏度大，大豆蛋白结构无法展开，疏水性差，导致乳液稳定性差。随着大豆蛋白含量增加，大豆蛋白与壳聚糖相互作用，蛋白-多糖结构逐渐成立，乳液也趋于稳定[27]。

图1 大豆蛋白质量分数对CST乳液乳液活化指数和乳液稳定性指数的影响Fig.1 Effects of soybean protein mass fraction on CST emulsion ESI and EAI

2.2 大豆蛋白添加量对CST 乳液乳析指数及乳液状态的影响

由图2(a)可知，随着贮藏时间的增加，CST 乳液的乳析指数不断增加，添加质量分数3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白的CST乳液乳析指数在放置5 d时达到最高点，这可能是由于随着油相比例增大，乳液的乳清高度随贮藏时间的增加而增加，当大豆蛋白添加量低时，乳液无法形成稳定的蛋白-多糖复合结构，壳聚糖不能将全部的油滴吸附在其表面，自由的油滴容易聚合进而导致其破坏乳液稳定性。乳液状态如图2(b)所示，符合乳析指数的变化趋势。

图2 大豆蛋白质量分数对CST乳液乳析指数及乳液状态的影响Fig.2 Effects of soy protein mass fraction on the creaming index and status of CST emulsions

2.3 大豆蛋白添加量对CST 乳液内源性荧光强度的影响

内源性荧光常被用于检测蛋白质的色氨酸残基所处微环境变化及蛋白质三级结构变化，可以用来检测蛋白质空间结构的变化。如图3 所示，随着大豆蛋白浓度的升高，荧光谱图的最大荧光强度先升高后降低，添加质量分数3.2%大豆蛋白的CST乳液荧光强度最大。这可能是因为随着大豆蛋白浓度升高，大豆蛋白暴露的色氨酸增多，导致荧光谱图最大强度增加。随着大豆蛋白浓度继续升高，壳聚糖吸附在大豆蛋白表面形成颗粒，大豆蛋白表面暴露出的色氨酸减少导致荧光猝灭，使荧光谱图最大强度减小[28,29]。王柏棋等[10]在对酯化大豆蛋白与壳聚糖相互作用复合乳液的研究中也发现相似的结果。

图3 大豆蛋白质量分数对CST乳液荧光强度的影响Fig.3 Effects of soy protein mass fraction on fluorescence intensity of CST emulsion

2.4 大豆蛋白添加量对CST 乳液粒径、Zeta-电位和乳滴微观结构的影响

图4(a)所见，随着大豆蛋白浓度的增加，乳液的表面积加权平均粒径D(3,2)和体积加权平均粒径D(4,3)均呈现下降的趋势，但添加质量分数3.2%～4.8%大豆蛋白的CST 乳液粒径无显著差异（P＞0.05）。当大豆蛋白质量分数为1.6%时，乳液D(3,2)和D(4,3)分别为13.72 μm 和45.07μm，乳液中大豆蛋白质量分数为4.8%时，乳液D(3,2)和D(4,3)分别 为12.92 μm 和25.67 μm。其中添加质量分数3.2%大豆蛋白的CST乳液粒径最小。

图4 大豆蛋白质量分数对CST乳液粒径、电位及微观结构的影响Fig.4 Effects of soy protein mass fraction on particle size,potenial and microstructure of CST emulsions

Zeta-电位能够反映溶液中粒子表面电荷之间的相互作用，是影响乳液稳定性的重要参数之一，Zeta-电位绝对值越大，乳液体系越稳定[30]。如图4(b)所示，添加质量分数1.6%～4.8%大豆蛋白的CST乳液电位分别为（44.84±1.14）、（41.00±1.00）、（39.64 ± 0.83）、（37.3 ± 0.62）、（35.34±1.45）mV，随大豆蛋白浓度的增加而下降。图4(c)为CST乳液的光学显微镜拍摄照片。

2.5 CST乳液紫外全扫描光谱

如图5 所示，当紫外光谱的最大吸收波长为274 nm，添加质量分数1.6%、2.4%、3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白的CST 乳液光密度分别为1.836、1.369、1.056、0.792 和0.868，总体呈下降趋势，并且3.2%、4.0%、4.8%大豆蛋白添加量的CST 乳液光密度差别不大。说明3.2%、4.0%、4.8%的大豆蛋白添加量的CST 乳液中蛋白质与多糖、多酚等化合物的结合程度均较佳。

图5 大豆蛋白质量分数对CST乳液光密度的影响Fig.5 Effects of soya protein mass fraction on the optical density of CST emulsions

2.6 大豆蛋白添加量对CST乳液稳定性的影响

如图6(a)所示，质量分数1.6%大豆蛋白的CST乳液浊度最低（2.10），而质量分数2.4%～4.8%大豆蛋白的CST乳液浊度无显著差异（P＞0.05）。如图6(b)所示，质量分数1.6%、2.4%、3.2%、4.0%、4.8%大豆蛋白的CST 乳液蛋白溶解度分别为0.57、0.24、0.64、0.65和0.49。质量分数3.2%和4.0%大豆蛋白的CST 乳液溶解度最大，但两者无显著差异（P＞0.05）。结果表明，质量分数3.2%大豆蛋白的CST乳液蛋白溶解度最大，这与浊度、紫外全扫描结果相符合。

图6 大豆蛋白质量分数对CST乳液稳定性的影响Fig.6 Effects of soy protein mass fraction on the stability of CST emulsions

较小的物理稳定性值表明离心过程对乳液中分散颗粒的漂浮和下沉的影响较小[15]。如图6(c)所示，质量分数1.6%、2.4%、3.2%、4.0%、4.8%大豆蛋白的CST 乳液物理稳定性分别为0.84、0.84、0.67、0.84 和0.79。其中质量分数3.2%大豆蛋白的CST乳液物理稳定性显著低于其他浓度乳液（P＜0.05），这是由于大豆蛋白添加质量分数为3.2%时，CST乳液中大豆蛋白与壳聚糖结合的更加紧密，致使其形成稳定的大分子结构，从而增强了乳液的稳定性[31]。综上可得，大豆蛋白的添加能增强乳液的稳定性，这与陈智慧等[17]结果类似。

2.7 大豆蛋白添加量对CST乳液美拉德反应物的影响

D294nm和D420nm可分别指示美拉德反应的中间化合物（重要前体）和棕色聚合物，可与游离氨基酸和小分子肽在美拉德反应的高反应性有关[24]。如图7所示，随着大豆蛋白添加量的增加，D294nm和D420nm均先升高后降低，添加质量分数3.2%大豆蛋白的CST乳液D294nm、D420nm最大，D420nm变化不显著（P＞0.05），说明3.2%大豆蛋白添加量的CST 乳液的美拉德反应物生成最多，可能是大豆蛋白、壳聚糖和百里香酚等多种物质之间互相结合比其他浓度更加紧密，这与浊度、蛋白溶解度等指标结果相符。Meng等[32]研究表明，在不使用任何其他化学品的情况下，蛋白质的氨基可与壳聚糖还原端的羰基或任何其他还原性羰基相连，通过美拉德反应形成多糖-蛋白质复合物。

图7 大豆蛋白质量分数对CST乳液美拉德反应物的影响Fig.7 Effects of Soya Protein Mass Fraction on Meladic Reactants of CST Emulsions

2.8 大豆蛋白添加量对CST乳液表面疏水性的影响

乳液表面疏水性与其乳液稳定性、乳化能力、乳化稳定性密切相关，可以体现出疏水性官能团的数量，对蛋白质功能特性有显著影响[33]。如图8 所示，随着大豆蛋白浓度的增加，乳液表面疏水稳定性先增加后减少，在乳液中大豆蛋白质量分数为3.2%时达到最大。这可能归因于随着大豆蛋白浓度增加，大豆蛋白与壳聚糖相互作用，且大豆蛋白浓度升高，从而使大豆蛋白结构展开，导致更多的疏水基团被ANS探针结合，使大豆蛋白乳液疏水性升高。当大豆蛋白含量较低时，壳聚糖含量较高，乳液黏度较高，蛋白质-多糖结构在乳液中不能完全舒展，被紧紧包裹，使疏水性较低。当大豆蛋白浓度过高时，壳聚糖大豆蛋白并不能完全结合，导致暴露出的疏水性基团较少，所以疏水性较弱。

图8 大豆蛋白质量分数对CST乳液表面疏水性的影响Fig.8 Effects of soy protein mass fraction on the surface hydrophobicity of CST emulsions

2.9 CST乳液对鲈鱼片贮藏期间菌落总数的影响

为验证CST 乳液的抑菌性能，对未经处理和经大豆蛋白质量分数为3.2%的CST 乳液处理的鲈鱼肉片进行贮藏实验。如图9 所示，对照组在0、1、2、3、4 d 的菌落总数对数值lg [TVC/(CFU/g)]分别为3.77、4.88、6.81、7.65 和7.91，实验组在0、5、10、15、20 d 的lg [TVC/(CFU/g)]分别为1.72、2.10、4.40、5.49 和7.17。根据GB2733—2015《鲜、冻动物性水产品》规定，lg[TVC/(CFU/g)]＞6即为腐败。本研究可明显看出，乳液浸泡后的鱼肉抗菌能力远超于未经过乳液浸泡过的鱼肉。对照组在2 d 已经超过腐败阈值，而实验组可以将货架期延长至20 d，这与徐瑞等[34]实验结果相似。这归因于壳聚糖中的阳离子与细胞膜互作从而破坏细胞结构，而百里香酚通过疏水键和氢键结合膜蛋白发挥其抗微生物作用，壳聚糖与百里香酚协同作用能提高乳液抗菌能力。

图9 大豆蛋白质量分数3.2%的CST乳液对鲈鱼片菌落总数的影响Fig.9 Effects of CST emulsion with 3.2%mass fraction of soy protein on value of total colony count of sea bass fillets

2.10 CST乳液对鲈鱼片贮藏期间pH的影响

如图10 所示，对照组在0、1、2、3、4 d 的pH 分别为6.71、6.81、6.85、6.86 和6.74，实验组在0、5、10、15、20 d 的pH 分别为5.15、5.22、5.51、5.44 和5.50。总体来看是上升趋势，但经乳液浸泡后的鱼肉20 d内pH 变化不大。在贮藏开始阶段，pH 值较低是由于厌氧细菌呼吸产生乳酸，之后pH 值增加是由于微生物和内源性酶解蛋白质产生的生物胺、氨和其他碱性物质等的积累[10]。

图10 大豆蛋白质量分数3.2%的CST乳液对鲈鱼片pH的影响Fig.10 Effects of CST emulsion with 3.2%mass fraction of soy protein on the pH of sea bass fillets

2.11 CST 乳液对鲈鱼片贮藏期间总挥发性盐基氮含量的影响

如图11所示，随着贮藏时间的延长，鱼肉TVB-N含量逐渐升高。对照组在0、1、2、3、4 d的TVB-N质量分数分别为18.18、18.77、19.21、31.49和36.52 mg/100 g，实验组在0、5、10、15、20 d 的TVB-N 质量分数分别为15.39、17.10、17.18、18.08 和19.85 mg/100 g。空白组在贮藏2 d已经接近腐败阈值（20 mg/100 g），而实验组可以将货架期延长至20 d。TVB-N 的增加是因为微生物和酶使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，使用CST 处理的肉，因其中壳聚糖的抗菌活性可以减缓微生物诱导的蛋白质分解，且百里香酚可进一步增强抗菌效果[35]。因此，相对于对照组，乳液处理的鲈鱼片拥有更好的保鲜能力，并且使鱼肉在10 ℃的货架期提高至少17 d。

图11 大豆蛋白质量分数3.2%的CST乳液对鲈鱼片总挥发性盐基氮的影响Fig.11 Effects of CST emulsion with 3.2%mass fraction of soy protein on total volatile saline nitrogen of sea bass fillets

3 结论

改变CST 乳液中大豆蛋白的质量分数会影响乳液的稳定性。在大豆蛋白添加质量分数为3.2%时，CST 乳液EAI 和ESI 达到最大值；随着大豆蛋白浓度升高，CST 乳液乳化性先升高后减小，在大豆蛋白添加质量分数为3.2%时乳液最稳定。此时乳液粒径较小，为（13.05±0.05）μm，且Zeta-电位较高，达到（39.64±0.83）mV，表面疏水性、美拉德反应物生成指数、最大荧光强度、乳液浊度、蛋白溶解度、稳定指数都是最佳。CST 乳液处理对鱼肉有保鲜能力，可以将大口黑鲈肉货架期延长至20 d。

综上所述，当大豆蛋白质量分数为3.2%时，CST 乳液（其中壳聚糖质量分数0.5%，百里香酚乳液质量分数1.0%）性能最佳，经此乳液处理后的鱼肉货架期可延长至20 d。