冷藏凡纳滨对虾肌肉软化的生化特性及生物标记物

徐德峰，廖威龙，李彩虹，廖建萌，李 欣

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2.广东医科大学海洋医药研究院，广东 湛江 524023；3.湛江市食品药品研究所，广东 湛江 524000；4.桂林理工大学化学与生物学院，广西 桂林 541000）

作为全球海洋养殖业重要支柱，凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾）不仅在全球对虾总产量中占据主导地位（约占80%），而且其在食品安全和营养供给方面的作用日益凸显。据2023年中国渔业统计年鉴数据，凡纳滨对虾海水养殖产量达到134.28万t，淡水养殖达到75.83万t[1]，已成为我国优质食物蛋白质的重要来源[2]。虽然凡纳滨对虾市场需求日益增长，但肌肉软化问题一直是影响其商品价值的主要因素。对虾肌肉组织柔嫩，在冷藏过程中极易发生以肌肉软化为代表的质构品质劣变，4 ℃冷藏条件下货架期仅为72 h，严重影响其感官品质和商品价值[3-5]。针对这一问题，本研究致力于探明冷藏对虾肌肉软化背后的生化机制及其生物标记物，深化品质劣变的理论认知，为鲜活对虾质量保真提供理论指导。

肌肉软化是一系列复杂生化事件的结果，肌纤维是维持肌肉硬度等质构品质的主要物质基础，而内源酶诱导的肌纤维降解是肉品质构劣化的关键生物学过程。研究发现，畜禽动物死后初期，细胞有氧呼吸停止而无氧呼吸增强，糖原消耗使乳酸累积，细胞内质子梯度增大，形成的跨膜质子梯度可间接激活Na+或Ca2+交换蛋白，促进胞外Ca2+内流，并诱导肌浆内质网Ca2+瞬间大量释放；与此同时，ATP水平、Ca2+-ATP酶、轻链蛋白激酶、磷酸酶、蛋白激酶活性也发生相应变化，上述生化因子相互作用直接影响到肌肉软化进程。但比较后发现，猪、牛、鸡等动物在贮藏期间的pH 值、Ca2+浓度、ATP 水平、代谢酶活性等生化因子的变化规律并不一致，这可能是因为不同动物肌肉品质劣化进程取决于无氧代谢启动后生物标记物的演替速度，相互间具有物种特异性[6-8]。Xu 等[9]发现对虾在冷藏期间挥发性盐基氮TVB-N 含量快速增加，肌纤维间隙增大，肌肉内膜破裂，肌肉快速软化；Peng 等[10]强调内源性酶在对虾死后加速肌肉软化过程中的潜在作用。Bouskila等[11]发现葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）参与糖酵解或糖异生途径，可催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的相互转化产生能量使肌肉收缩。以上研究均指明肌肉软化与生化代谢之间的密切关联。然而，目前关于对虾冷藏期间肌肉软化与生化代谢因子间相关性的研究尚未见报道。

本研究通过监测凡纳滨对虾冷藏期间肌肉生化因子水平和磷酸化调控酶活性，分析其与质构指标的相关性，探明肌肉软化相关的生化关系，进而识别生物标记物，以期为对虾冷藏期间质构劣化的早期预警与靶向监控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要药品试剂

蒽酮（分析纯AR），上海化学试剂公司；苯甲磺酰氟（PMSF，AR），碧云天生物技术有限公司；ATP含量测定试剂盒、超微量Ca2+-ATP 酶试剂盒、酸性及碱性磷酸酶(ACP、AKP)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，飞净生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

PHS-3E型雷磁pH仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；TMS-PRO质构仪，美国FTC公司；Varioskan全自动酶标仪，塞默飞世尔科技中国有限公司。

1.3 原料

鲜活凡纳滨对虾，体质量（12.26±1.52）g，体长（8.25 ± 1.43）cm，购于广东省湛江市麻章区东南水产品市场，充氧后2 h 内保活运输至广东海洋大学食品科技学院水产品保活流通实验室进行预处理。选取无表面损伤且存活状况良好的个体，自来水清洗后加冰块使其猝死，用自来水洗净体表，每6尾作为一组，装入聚乙烯塑料保鲜袋，4 ℃冷藏120 h，每12 h取出一组测定相关指标。

1.4 方法

1.4.1 质构分析（TPA）参照王伟等[12]法测定质构指标。将对虾去头、剥壳，放到测试台中间，选取第二腹节进行质地多面分析。选用直径为50 mm 的P50 平底柱形探头，测前速度2.00 mm/s，测试速度1.00 mm/s，测后速度1.00 mm/s，压缩程度50%。测定硬度、弹性、内聚力、咀嚼性、剪切力等参数。

1.4.2 肌原纤维蛋白提取 参照Lametsch 等[13]法稍修改。选取多尾虾的第二腹节，切碎，称100 mg 碎肉于组织匀浆管中，加入缓冲液（1 mL裂解缓冲液，10 μL PMSF，10 μL蛋白酶抑制剂和10 μL磷酸酶抑制剂）混合，在4 ℃、3 000 r/min 条件下匀浆2 min，冰上裂解30 min，在4 ℃、4 000 r/min 条件下离心5 min，收集上清液保存于-80 ℃的冰箱中待用。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

1.4.3 肌原纤维小片化指数（MFI）测定 参照Wu等[14]法，将蛋白溶液质量浓度调至（0.5 ± 0.05）mg/mL，记录波长540 nm 处的光密度，其平均值乘以200 即为MFI。

1.4.4 无氧条件下各生化因子指标测定 pH值测定参照Salih 等[15]法进行。糖原含量、乳酸含量、ATP含量、酸性与碱性磷酸酶（ACP、AKP）活性、Ca2+-ATP酶活性测定使用南京建城生物工程研究所生产的相关试剂盒，按照说明书依次测定。

1.5 数据处理

各指标平行测定3 次，数据用平均值± 标准偏差表示，采用SPSS 22.0 对数据进行统计分析，多重比较采用单因素方差分析，使用Origin 8.5 和GraphPad Prism 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 冷藏期间对虾肌肉质构与纤维断裂情况变化

质构特性能够反映凡纳滨对虾的新鲜程度[16]。由图1(A)可知，随着冷藏时间的增加，对虾肌肉硬度呈下降趋势，在冷藏72 h 后硬度迅速降至（2947±113）g。由图1(B)可知，弹性与硬度呈相同变化趋势，从初始的1.42±0.05降至120 h的0.66±0.01；由图1(C)可知，对虾内聚力在冷藏期间持续下降，由初始的0.62±0.02，降至120 h时的0.32±0.01，而咀嚼性从最初的（2524±127）g降至120 h的（504±51）g（图1(D)）。说明冷藏时间延长显著影响凡纳滨对虾肌肉的硬度、弹性、内聚力和咀嚼性，直接指示其新鲜度下降。研究发现，在冷藏条件下，羊肉和鲈（Lateolabrax japonicus）鱼肉的硬度随冷藏时间增加而上升，而对虾的肌肉质构指标则呈下降趋势[17,18]。这表明不同物种在冷藏后肌肉质构指标的变化具有显著差异。对虾死后，特定蛋白酶从肝胰腺迁移到肌肉，加速肌原纤维蛋白的降解，导致肌肉快速软化，通过蛋白质组学分析揭示了蛋白酶促进死后肌肉代谢的作用，这可能是对虾短暂尸僵期和快速软化的原因[10]。MFI是反映对虾肌肉完整性的一个重要指标[19]。由图1(E)可知，对虾肌肉MFI随着冷藏时间的增加而增大。对虾初始MFI 为21.63 ± 0.29，36 h 时升至62.13 ± 3.40，表明24 h 后肌肉纤维快速降解。进一步分析发现，MFI 与对虾质构相关指标均显著负相关（P＜0.01）（图1(F-I)），说明肌原纤维碎片化与质构品质劣变存在一定的因果关系。MFI 增加表明肌原纤维完整性受到破坏，可能源于细胞内结构降解酶活性增加而引起结构蛋白断裂，使蛋白质网状结构强度降低，肌原纤维中的粗丝加速降解，表现出肌肉组织软化[20]。李晓等[21]研究发现，0 ℃贮藏凡纳滨对虾，质构指标均与贮藏时间呈负相关；Sun 等[22]发现在微冻条件下，对虾在10 d时MFI呈显著上升，与本研究趋势一致，而与本研究MFI 显著上升出现时间上的差异，可能是因为微冻低温贮藏抑制了对虾体内生物化学反应，延缓了对虾品质劣化。

图1 冷藏对虾主要质构指标和MFI的动态变化及其相关性Fig.1 Dynamic variation on primary textural indexes and MFI of refrigerated prawn,and the correlation between MFI and each index

2.2 冷藏对虾肌肉组织生化代谢变化

在对虾死后，机体会启动细胞凋亡过程，伴随内源酶的激活可引起各种生化代谢发生规律变化[23]。由图2 可知，对虾冷藏24 h 内pH 值下降，之后明显增加（图2(A)）；肌肉糖原质量分数在初期24 h内快速下降，由最初的（0.35±0.02）降至（0.28±0.02）g/100g，而后缓慢下降（图2(B)）。在氧气供应不足的环境下，细胞会启动无氧糖酵解代谢途径，将糖原分解为乳酸，并在此过程中不断积累，导致细胞环境酸化，这与pH 值的变化相符，提示细胞内酸碱平衡受到无氧糖酵解的影响[24]。由图2(C)可知，丙酮酸质量摩尔浓度先快速上升至峰值，由（1.30±0.15）mmol/100g升至36 h的（2.85±0.08）mmol/100g，之后持续下降，提示细胞代谢类型发生变化。Chen等[25]指出糖原和乳酸作为糖酵解反应的底物和产物，其含量变化直接反映糖酵解水平和速率。在前24 h 内，糖原被快速分解产生丙酮酸后，在细胞缺氧的环境下乳酸质量摩尔浓度快速增加（图2(D)），由（0.06 ± 0.01）mmol/g 升 至24 h 时 的（0.23 ±0.01）mmol/g，之后快速下降，直至120 h 时的（0.09±0.01）mmol/g，表明冷藏前24 h大多数丙酮酸转变成乳酸。王源源等[26]研究干露对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）成虾存活、相关代谢酶及组织结构的影响，发现其代谢酶活性变化趋势与本研究类似，说明冷藏初期细胞代谢模式转变为无氧呼吸。

图2 冷藏对虾糖酵解过程各指标变化Fig.2 Changes of each index related to glycolysis process

鉴于物质代谢与能量代谢的密切相关性，进一步考察冷藏过程中对虾肌肉中ATP 的含量变化。由图2(E)可以看出，新鲜对虾肌肉中ATP 质量摩尔浓度为（339.88±8.44）μmol/g，48 h 降至（53.55±1.39）μmol/g，仅为初始值的15%，72 h 时ATP 消耗完毕。通常，乳酸堆积造成pH 值下降，使肌浆网的Ca2+滞留能力下降，Ca2+大量释放至细胞外，促使肌原纤维间Ca2+浓度增加，进而激活ATP 酶使ATP 迅速降解[27]。磷酸果糖激酶（PFK）是肌肉糖酵解最重要的限速酶。在糖酵解反应中，PFK 催化的反应为不可逆反应，PFK 对糖酵解的驱动有着至关重要作用[28]。由图2(F)可知，在冷藏至24 h 时，PFK 活性显著下降至（20.82±0.32）U/mg，之后逐步降至（11.13±0.10）U/mg。林珩迅等[29]发现，ATP含量降低可能导致糖酵解途径中所需的能量供应不足，限制PFK 的催化活性。此外，ATP 的降低也可能引起代谢途径中其他关键酶的活性下降，如磷酸己糖激酶（PGK）和磷酸甘油醛-3-脱氢酶（GAPDH），进一步影响肌肉组织中的代谢类型[30]。

2.3 对虾冷藏过程中磷酸酶和Ca2+-ATP 酶活性变化

ACP、AKP 参与磷酸基团的代谢，与蛋白质代谢有关[31]。由图3 可知，ACP 和AKP 活性从0 h 至60 h 基本不变，72 h 后开始上升，其中ACP 活性在120 h 升至（26.57±1.53）U/g，AKP 活性升至（1.46±0.10）U/g。此外，肌原纤维蛋白是水产品中最重要的结构和功能蛋白，其中肌球蛋白占肌原纤维蛋白的55%～60%[32]，而肌球蛋白稳定性与Ca2+-ATP 酶活性有关，Ca2+-ATP 酶活性越高，肌肉蛋白质越稳定[33]。如图3(B)所示，冷藏期间对虾肌肉Ca2+-ATP酶活性不断下降，由初始（0.54±0.01）降至120 h 时（0.15±0.01）U/mg，下降近乎4 倍，间接反映肌原纤维的解离降解。通常，ATP 快速下降使Ca2+-ATP 酶可利用的能量不足，影响钙泵功能，诱导肌浆内质网Ca2+大量释放，从而激活酸性或碱性磷酸酶的活性，促进蛋白质分解[34]。

图3 磷酸酶和Ca2+-ATP酶活性变化Fig.3 Changes in phosphatase and Ca2+-ATPase activity

2.4 冷藏对虾肌肉软化与各生化指标间的相关性

各指标间相关性见图4。对虾冷藏期间，质构指标与MFI 指数间显著负相关（P＜0.05），与Ca2+-ATP 酶活性显著正相关（P＜0.05），其生化规律可能是对虾死后肌肉代谢减缓，Ca2+-ATP酶活性下降，细胞内Ca2+浓度升高，打破细胞内的钙离子平衡，激活钙蛋白酶参与肌原纤维降解，随后肌原纤维碎片化增加和质构特性劣变，尤其是硬度和弹性指标快速下降。在各指标中Ca2+-ATP 酶活性与硬度相关性最强（R2=0.98），可能是因为Ca2+-ATP 酶在细胞内钙离子调控和能量代谢中的关键作用，Ca2+-ATP 酶是一种负责细胞内钙离子平衡的酶，其活性直接影响细胞内的Ca2+浓度[35]。当Ca2+-ATP 酶驱动Ca2+从细胞质或其他细胞区域转运到内质网，导致细胞质中的游离Ca2+减少，内质网Ca2+浓度相对升高，触发肌肉细胞中的肌钙蛋白与肌动蛋白的结合，引发肌肉的收缩反应[36]。同时可以看出，质构指标与磷酸酶活性表现出负相关关系，其原因可能是冷藏后期微生物繁殖使细胞结构破裂，细胞内核酸、磷脂和碱性磷酸盐等细胞成分不断释放和聚集，间接诱导ACP或AKP激活，从而加速蛋白质降解。这一过程会破坏对虾肌肉的结构，导致肌肉组织松散，失去原有的紧密结构。Ca2+-ATP酶活性与磷酸酶活性呈显著负相关（P＜0.05），Ca2+-ATP 酶活性下降通常与细胞内钙稳态失衡有关，其活性下降被视为一种细胞应激反应，应激响应通常涉及MAP激酶（MAPK）通路，从而通过磷酸化下游目标蛋白来改变其活性或定位[37-40]。

图4 凡纳滨对虾冷藏过程中各指标相关性分析Fig.4 Correlation analysis of various indexes during cold storage of Litopenaeus vannamei

鉴于物质代谢与能量代谢的密切相关性，进一步分析糖代谢相关生化因子与肌原纤维降解的相关性有助于探明肌肉软化的生物标记物。由图4可见，MFI 指数与pH、糖原含量显著负相关性（P＜0.05），这是因为在对虾冷藏过程中，肌肉内源酶的活性变化会影响肌原纤维降解，能量代谢速率减缓从而导致酸碱平衡失调。从生化代谢角度分析，ATP 是细胞内能量的主要供应者，其通过释放高能磷酸键来提供能量给各种生化反应。糖原作为能量储存分子被降解成丙酮酸、乳酸和ATP，酸性物质堆积使pH 值下降，反过来影响PFK 的催化活性，导致糖酵解速率降低。另外，PFK 是一种依赖于ATP的酶，当ATP 水平较低时，PFK 催化反应所需的高能磷酸键就会减少，PFK 的催化速率会受阻，进一步降低糖酵解速率，与经典Michaelis-Menten 动力学理论相一致，说明PFK 驱动的糖酵解可能是触发和加速肌肉快速软化的关键前期生化事件。能量代谢是维持细胞生存和功能的基础，其与对虾肌肉的质构特性密切相关[41]。ATP含量与质构指标之间显著正相关性（P＜0.05），ATP 在肌肉收缩机制中起着关键作用，新鲜对虾中ATP 含量较高，可以维持收缩状态，从而使肌肉保持一定的结构稳定性和弹性。随着冷藏时间的推移，ATP 生成减少而消耗增多，造成Ca2+-ATP酶转移Ca2+的能力下降，从而使细胞内钙离子浓度升高，最终激活钙蛋白酶并降解肌原纤维，增加肌原纤维碎片化的程度。综上所述，Ca2+-ATP 酶在各指标间相关性最强，可作为冷藏对虾以肌肉软化为代表的质构劣化的生物标记物。

2.5 Ca2+-ATP酶驱动肌肉软化的可能机制

基于细胞内生化代谢路径及其生物学效应，分析Ca2+-ATP 酶驱动肌肉软化的可能机制，提出如下科学假说（图5）。

图5 Ca2+-ATP酶驱动冷藏对戏肌肉软化的可能机制Fig.5 Potential mechanisms of muscle softening driven by Ca2+-ATPase in shrimp during cold storage

在4 ℃冷藏初期，由于对虾死亡而呼吸终止，细胞失去氧气供应，无氧呼吸取代有氧呼吸，对虾肌肉中的糖原通过糖酵解和无氧呼吸生成丙酮酸和少量ATP，随后丙酮酸被氧化为乙酰辅酶A，转运到线粒体进行三羧酸循环（TCA 循环），最终转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），通过电子传递链进行氧化磷酸化产生ATP，而Ca2+-ATP 酶在细胞内维持Ca2+浓度平衡起着关键作用，其通过消耗ATP主动转运Ca2+，将细胞内的Ca2+从低浓度区域（通常是细胞质或细胞膜内侧）转运到高浓度区域（如内质网、细胞外区域）。随着能量代谢减缓，ATP 生成速率降低，导致Ca2+-ATP 酶的钙泵功能受阻，影响Ca2+的正常转运，使内质网释放的Ca2+在肌肉细胞内大量积累，导致细胞内Ca2+异常升高，进而激活钙蛋白酶并降解肌原纤维蛋白和细胞骨架蛋白，引起肌肉软化。

3 结论

本研究发现，对虾冷藏初期肌肉质构品质指标快速下降，且与肌原纤维碎片化密切相关。伴随着糖原含量快速下降，丙酮酸和乳酸累积，且ATP含量急剧降低，PFK 活性受抑制，导致糖酵解速率减缓。冷藏24 h 之后，ACP 和AKP 活性快速增加，促使肌原纤维蛋白去磷酸化，影响肌原纤维的结构稳定性，从而触发和加速肌肉快速软化。冷藏初期，对虾质构快速劣化受关键内源酶的协同激活，PFK 驱动的糖酵解可能是触发和加速肌肉快速软化的关键前期生化事件，其中Ca2+-ATP酶是生物标记物。