施氮活化根际土壤磷素促进粗齿冷水花的磷素积累

唐 瑞，蒲 勇，戴文颖，余海英，李廷轩，叶代桦*

（1 四川农业大学资源学院，四川成都 611130；2 泸州市现代农业发展促进中心，四川泸州 646000；3 成都环境创新科技有限公司，四川成都 610000）

磷是植物生命活动所必需的大量营养元素，然而土壤磷多以植物难以直接吸收利用的形态存在[1]。为满足植物生长需求，提高作物产量，农业生产中大量磷肥施入土壤[2]，但长期不合理施用会带来磷矿资源耗竭和水体富营养化风险等系列问题[3]。土壤有效磷含量超过45 mg/kg (以P2O5计)被视为磷素过剩[4]，据统计，我国磷肥施用量已占全球施用总量的52%，全国农田土壤从南到北全磷含量变幅为 0.31～1.72 g/kg，有效磷含量变幅为 91.5～420.0 mg/kg，集约化耕作土壤的磷累积现象严重，平均磷累积量高达 242 kg/hm2[5-7]。利用磷富集植物提取土壤过量磷，降低环境污染风险；植物收获后又可作为绿肥资源，实现资源绿色高效利用[8]。Duo grass、多花黑麦草(Loliummultiflorum)、澳洲狐尾(Ptilotuspolystachyus)等植物因磷含量高(＞1%)或适应高磷环境等特点被认为是较有潜力的磷富集植物[9-11]。但它们植株生物量较小，导致磷积累量较小，磷提取率较低。研究发现，粗齿冷水花(Pileasinofasciata)在高磷处理下，地上部生物量和磷积累量分别可达到31.12 g/plant 和223.73 mg/plant，是修复磷过剩土壤的优势植物[12]。

氮是植物生长发育所必需的大量营养元素，氮肥的供应对植物生长发育和磷吸收具有重要影响[13]。施氮能显著提高磷富集植物狗牙草(Cynodon dactylon)[14]、百喜草(Paspalumnatatum)[15]、水蓼(Polygonumhydropiper)[16]等的生物量和磷含量，有效提高植物磷积累能力。据报道，施氮能提高植物叶片光合作用，促进光合产物积累，增加生物量；施氮也能提高植物磷酸盐吸收相关基因表达，增加植物根际土壤有效磷含量，促进植物磷吸收，从而提高植物磷积累[17-19]。

然而，施氮是否能提高磷富集植物对不同浓度高磷的耐性？施氮提高磷富集植物的磷积累能力和磷提取效率的作用机制是什么？这些问题均有待进一步探讨。植物磷提取能力不仅取决于自身生理特性，也受根际土壤磷有效性的影响[20]。土壤磷有效性与土壤不同组分磷含量密切相关[21-22]。连续浸提法将土壤磷划分为H2O、NaHCO3、NaOH、HCl 提取态有机磷和无机磷，以及残渣态磷[22]。其中，H2O 和NaHCO3提取态磷为有效性较高的磷形态，易被植物吸收利用；NaOH 提取态磷为植物的潜在磷源，HCl提取态和残渣态磷较稳定，通常需矿化分解为有效性更高的磷形态才能被植物获取[23]。含磷化合物的矿化分解过程主要发生在根际土壤中，受根际土壤磷酸酶和微生物的驱动[24]。土壤磷酸酶影响土壤含磷物质的分解率，其活性高低受植物根系和土壤微生物的共同影响[25]。施氮是否通过影响根际磷的形态转化进而促进植物磷吸收尚不清楚。因此，了解施氮对植物根际土壤磷组分、磷酸酶和微生物活性的影响具有重要意义。

前期研究发现，施氮后粗齿冷水花磷富集能力增强，其生物量和磷积累量随施氮量增加先升高后降低，且均在施氮量为140 mg/kg 时达到最大[26]。因此，本研究利用已筛选出的磷富集植物矿山生态型粗齿冷水花为材料，探讨适宜施氮处理对矿山生态型粗齿冷水花磷积累能力和根际土壤磷素特征的影响，揭示施氮促进粗齿冷水花磷吸收积累的根际过程，为后期合理利用粗齿冷水花提取环境中过剩磷提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物为粗齿冷水花(Pileasinofasciata)。其中，矿山生态型(mining ecotype，ME)采自四川省什邡市磷矿区(104°50′E，30°25′N)，非矿山生态型(non-mining ecotype，NME) 采自雅安市雨城区(102°59′E，29°58′N)。

供试土壤为灰潮土，采自四川省都江堰市蒲阳镇，基本理化性质：pH 7.1，有机质含量22.9 g/kg，全氮含量1.03 g/kg，碱解氮含量39 mg/kg，有效磷含量14.4 mg/kg，速效钾含量46 mg/kg。

供试肥料：尿素(N 46%)、磷酸二氢钾(P2O552.1%; K2O 34.6%)、硫酸钾(K2O 54%)。

1.2 试验设计与处理

盆栽试验设4 个磷(P) 水平：0、400、800、1200 mg/kg，分别记作P0、P400、P800、P1200；2 个氮(N)水平：0、140 mg/kg，记作N0、N140。每处理重复4 次，共64 盆，完全随机排列。采用土培盆栽试验，土壤风干后，压碎过2 mm 筛混匀，每盆(8 L)装土8 kg。磷、钾配成溶液一次性施入土壤(每盆配施相应量的K2SO4以平衡土壤中因施入KH2PO4而带入的钾)，充分混匀陈化8 周，幼苗移栽前3 天将氮肥(尿素)配成溶液加入土壤。

粗齿冷水花采用扦插育苗，幼苗的扦插管理采用刘霜等[27]的方法。待幼苗于蛭石中生根培养40 天后，选择长势一致的幼苗移栽至塑料盆中，每盆种2 株。每周浇水2～3 次，按田间持水量的70%确定灌水量，及时除草、防治病虫害，采用自然光照，并记录植株生长状况，试验于四川农业大学教学科研园区有防雨设施的网室中进行。

1.3 样品采集与制备

于移栽后11 周采样。植物样品先用自来水冲洗再用蒸馏水润洗，洗净后用吸水纸擦干。将其分为地上部和地下部，分别装袋后于105℃条件下杀青30 min，75℃条件下烘干至恒重，粉碎后过1 mm 筛用于磷含量测定。土壤样品采用抖土法收集，收集粘附在根表的土壤作为根际土，其余土壤整盆混匀后采集部分作为非根际土，一部分土壤样品用保温箱低温带回后存于-20℃冰箱，用于土壤酶活性和微生物指标的测定；一部分土样经自然风干后磨碎过筛，用于土壤磷组分及其他化学性质的测定。

1.4 测定项目及方法

植株地上部生物量(干重) 采用烘干称重法测定；植株磷含量采用H2SO4-H2O2消煮—钒钼黄比色法[28]测定。土壤基本理化性质采用常规分析方法[28]测定；土壤磷组分采用Tiessen-Moir[22]的方法测定；土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性采用对硝基苯磷酸二钠法测定[28]；植酸酶参考Ramesh 等[29]的方法测定；土壤微生物生物量碳、氮均采用氯仿熏蒸浸提测定[30-31]；土壤微生物基础呼吸量、基质诱导呼吸量均采用静态碱液吸收法测定[32]。

1.5 数据处理

磷积累量P accumulation (mg)=生物量Biomass(g) × 磷含量 P concentration (mg/g)。

采用SPSS (22.0)进行统计分析，选择LSD 法进行多重比较，图表制作采用Excel (2016)和Origin(2018)完成。

2 结果与分析

2.1 施氮处理对粗齿冷水花磷积累能力的影响

2.1.1 生物量 随磷浓度增加，两种生态型粗齿冷水花地上部和地下部生物量均先升高后降低，ME 生物量高于NME (图1)。高磷条件下，与不施氮相比，施氮显著增加了两种生态型粗齿冷水花生物量，ME 和NME 地上部生物量分别增加27.5%～72.5% 和18.7%～80.1%，地下部生物量分别增加29.7%～103.7%和3.6%～75.6%。不施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花地上部和地下部生物量均在高磷800 和1200 mg/kg 处理时受到抑制，生物量降低；施氮处理提高了两种生态型粗齿冷水花对高磷的耐性，其生物量在高磷800 mg/kg 处理时达到最大，ME 和NME 地上部生物量分别为27.2 和23.0 g/plant，ME 是NME 的1.18 倍。表明施氮处理不仅能提高粗齿冷水花生物量，还能提高植株的高磷耐受能力，且ME 高磷耐受能力强于NME。

图1 施氮对两种生态型粗齿冷水花地上部和地下部生物量的影响Fig.1 Effects of N application on shoots and roots biomass of the two ecotypes of P.sinofasciata

2.1.2 磷积累量 随磷浓度增加，两种生态型粗齿冷水花地上部和地下部磷积累量均先升高后降低，ME 的磷积累量高于NME (图2)。高磷条件下，与不施氮相比，施氮显著增加了两种生态型粗齿冷水花磷积累量，ME 地上部和地下部磷积累量最大增幅分别为78.7%和63.2%，NME 最大增幅分别为125.6%和113.7%。不施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花磷积累量在高磷400 和800 mg/kg 处理时无明显差异，而施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花磷积累量在高磷800 mg/kg 处理时最大，ME 和NME 地上部磷积累量分别可达193.8 和155.8 mg/plant，分别是不施氮处理下植株地上部磷积累量的1.69 和1.52倍，而ME 是NME 的1.24 倍。表明高磷条件下施氮显著提高了粗齿冷水花的磷积累能力，ME 磷积累能力强于NME。

图2 施氮对两种生态型粗齿冷水花地上部和地下部磷积累量的影响Fig.2 Effects of N application on shoots and roots P accumulation in two ecotypes of P.sinofasciata

2.2 施氮处理对粗齿冷水花根际土壤磷组分的影响

施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花高磷耐受能力和磷积累能力在磷800 mg/kg 处理时最强。因此，选择高磷800 mg/kg 处理下的样品进行检测，分析其土壤化学特性变化特征。由表1 可知，与不施氮相比，施氮增加了两种生态型粗齿冷水花根际土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 含量，ME 根际土壤增幅分别为10.24%和20.47%，NME 增幅分别为14.69%和16.71%。此外，两种生态型粗齿冷水花根际土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 显著高于非根际，表现为明显的根际富集；根际土壤NaHCO3-Po 和NaOH-Pi/Po则相反，具有明显的根际损耗。表明施氮促进了粗齿冷水花根际土壤磷向有效性更高的组分转化，增加了粗齿冷水花根际土壤磷的有效性，有利于植株对磷的吸收。施氮处理下，ME 根际土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 含量显著低于NME 根际土壤，分别为NME 根际的90.13%和81.34%，其他磷组分在生态型之间无显著差异。表明ME 对根际有效性较高的磷组分的吸收能力强于NME。

表1 施氮对种植粗齿冷水花土壤磷组分含量的影响Table 1 Effects of N application on concentrations of P fractions in soils planted with P.sinofasciata

2.3 施氮处理对粗齿冷水花根际土壤磷酸酶活性的影响

由图3 可知，与不施氮相比，施氮处理显著提升了两种生态型粗齿冷水花根际和非根际土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶及根际植酸酶的活性。施氮处理下，除了 NME 土壤酸性磷酸酶活性外，两种生态型粗齿冷水花根际土壤磷酸酶和植酸酶活性均显著高于非根际土壤。此外，ME 根际土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶活性均高于NME，分别比NME高7.50%、15.05%和8.93%。表明施氮处理增加了两种生态型粗齿冷水花对根际土壤磷的矿化能力，ME 对根际土壤磷的有效化能力更强。

图3 施氮对两种生态型粗齿冷水花土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶活性的影响Fig.3 Effects of N application on activities of acid phosphomonoesterase, alkaline phosphomonoesterase and phytase in the soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.4 施氮处理对粗齿冷水花根际土壤微生物生物量和活性的影响

2.4.1 土壤微生物生物量碳、氮 由图4 可知，与不施氮相比，施氮处理显著提升了两种生态型粗齿冷水花根际土壤微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)含量，ME 与NME 根际土壤MBC 增幅分别为22.33%和25.21%，MBN 增幅分别为52.59%和56.06%。此外，在施氮处理下两种生态型粗齿冷水花根际土壤MBC、MBN 显著高于非根际土壤，而不施氮处理下无显著差异。表明施氮增加粗齿冷水花根际土壤微生物生物量，有利于根际土壤微生物对土壤养分的活化。

图4 施氮对种植粗齿冷水花土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮含量的影响Fig.4 Effects of N application on concentrations of microbial biomass carbon and nitrogen in the soils planted with P.sinofasciata

2.4.2 土壤微生物呼吸作用 由图5 可知，与不施氮相比，施氮处理显著提升了两种生态型粗齿冷水花根际土壤基础呼吸量和根际及非根际土壤基质诱导呼吸量，ME 增幅分别为15.74%、33.49%和36.80%，NME 增幅分别为15.67%、36.62% 和33.04%。此外，除NME 根际与非根际土壤基质诱导呼吸量无差异外，其余处理下两种生态型粗齿冷水花根际土壤基础呼吸量和基质诱导呼吸量均显著高于非根际土壤，而两种生态型间无明显差异。表明两种生态型粗齿冷水花根际土壤微生物呼吸作用更强，施氮能进一步提高根际土壤微生物的呼吸作用。

图5 施氮对种植粗齿冷水花土壤基础呼吸和基质诱导呼吸量的影响Fig.5 Effects of N application on basal respiration and substrate induced respiration in the soils planted with P.sinofasciata

3 讨论

3.1 高磷条件下施氮提高粗齿冷水花磷积累能力

磷富集植物耐受高磷的能力是其应用于修复磷过剩土壤的基础，植物的生长情况是其在胁迫环境下耐受能力的直接体现[33]。供磷水平过高，植物总根长和根际羧化物总量减少，导致植株根系对养分的吸收减少，进而影响植株正常生长发育[34]。施氮可促进植物生长发育，增强其对高磷的耐受能力，磷富集植物水蓼[16]、黑麦草和狗牙草[14]等地上部生物量在施氮后均显著增加。本研究中，施氮显著增加了两种生态型粗齿冷水花的生物量。此外，不施氮条件下，粗齿冷水花生物量在高磷800 和1200 mg/kg 处理时显著降低，生长明显受抑制；而施氮后粗齿冷水花在高磷800 mg/kg 处理时未受抑制，生物量显著提高，并且其在高磷1200 mg/kg 处理时的生长抑制也明显缓解。表明施氮可提高粗齿冷水花对高磷的耐受能力。

植物磷富集能力主要取决于地上部磷积累总量。适宜施氮能增加水稻[35]、玉米[36]、棉花[37]、番茄[38]、水蓼[16]等植物地上部磷积累量。施氮可通过增加植物根系分泌物量和种类，调节根际土壤pH 等以降低土壤对磷的固定，提高土壤有效磷含量[39]，有利于植物吸收磷；施氮对植物根系活力、根系形态等具有提升作用，可增强植物根系对磷的吸收能力[40]，进而促进植物磷积累。本研究同样发现，在适宜施氮处理下，ME 与NME 粗齿冷水花地上部磷积累量分别可达193.82 和155.81 mg/plant，分别是不施氮处理下植株地上部磷积累量的1.69 和1.52 倍，表明施氮可显著提高两种生态型粗齿冷水花的磷积累能力。

3.2 高磷条件下施氮促进粗齿冷水花根际土壤磷组分转化

植物根际土壤磷组分变化可反映植物对土壤磷的利用状况[21-22]。土壤H2O-P 和NaHCO3-P 是活性磷组分，NaOH-P 为中活性磷组分，HCl-P 和Residual-P为稳定性磷组分，植物在生长过程中较易获取的是土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi[41-42]。本研究中，两种生态型粗齿冷水花根际土壤有效性较高的H2O-P 和NaHCO3-Pi 组分含量增加，根际土壤NaHCO3-Po 含量降低，表明施氮可增加粗齿冷水花根际土壤磷的有效性，有利于植株对土壤磷的吸收利用。

植物根际土壤磷组分变化与植物根系吸收密切相关，有效性较高的磷组分易被植物吸收利用，导致土壤磷含量降低。玉米(ZeamaysL.) 和紫穗槐(Amorphafruticosa)根际土壤H2O-P、NaHCO3-Pi 明显损耗[43-44]；生长41 天的油菜(Brassicanapus)根际土壤NaHCO3-Pi 含量显著降低[21]；白羽扇豆(Lupinus albusL.) 根际土壤NaOH-Po 含量明显升高，而NaOH-Pi 含量有所降低[45]；多年生黑麦草(Lolium perenne)根际土壤NaOH-Pi 和NaOH-Po 含量明显损耗[46]。而在本研究中两种生态型粗齿冷水花根际土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 含量高于非根际土壤，根际土壤NaHCO3-Po、NaOH-Pi 和NaOH-Po 含量则低于非根际土壤。这可能是粗齿冷水花根系对土壤H2O-P和NaHCO3-Pi 的吸收量低于其他磷组分转化为H2OP 和NaHCO3-Pi 的总量，从而其在根际富集；同时，粗齿冷水花根际土壤磷酸酶和微生物活性高于非根际土壤，根际土壤NaHCO3-Po 和NaOH-Po 矿化水解程度剧烈，导致根际有效性较低的磷形态转化为有效性较高的磷形态。此外，施氮处理下，ME粗齿冷水花根际土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 低于NME，可能是ME 粗齿冷水花对土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi吸收能力更强所致。

3.3 高磷条件下施氮提高粗齿冷水花根际土壤磷酸酶和微生物活性

氮是植物和微生物生长代谢的必需营养元素之一，适量施氮能促进植物产生和分配较多的光合产物到地下部，根系分泌物种类和量增加，有助于植物对土壤磷的矿化分解[46]。土壤磷酸酶来源于植物根系和土壤微生物，其活性高低决定土壤有机磷的分解率[10]。土壤植酸酶是一种磷酸单酯水解酶，可专一性矿化分解土壤植酸磷[25]。土壤磷酸酶、植酸酶和微生物活性影响土壤磷的矿化分解速率[47]。前期研究发现，施氮增加了粗齿冷水花根系酸性磷酸酶和植酸酶活性[12]，根系分泌磷酸酶是根际土壤磷酸酶活性增加的原因之一；同时，根系分泌物为根际土壤微生物提供大量能量来源，有利于根际土壤微生物生长繁殖，使根际土壤微生物数量和活性大于非根际土壤，可在根际土壤产生更多的磷酸酶和植酸酶[48]。本研究发现，施氮处理下粗齿冷水花根际土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶活性均显著提高，有利于粗齿冷水花根际土壤磷的矿化分解。

土壤微生物在土壤磷循环过程中起重要作用，是土壤磷循环的调节者，土壤微生物活性增强可提高土壤磷周转率，进而增加磷酸盐离子向土壤溶液的转移，促进有机磷的迁移转化[49-50]。土壤MBC、MBN 和土壤呼吸强度是反映土壤微生物活性的重要指标[51]。施氮有利于土壤MBN 的保蓄，增加MBN的同化量；而对土壤MBC 未产生规律性影响[52]。土壤肥力水平较低时，施氮增加土壤矿化作用，减少土壤有机碳量，此时土壤微生物能量来源受限，土壤MBC 含量减少[53]。种植植物土壤中，施氮可促进植物生长发育，其根系分泌物为微生物提供更多碳源，进而增加根际土壤MBC 含量[54]。本研究中，施氮处理显著增加了粗齿冷水花根际土壤微生物生物量碳、氮且显著高于非根际土壤。这可能是施氮有效促进了粗齿冷水花根系生长发育，根系分泌物为根际环境提供了丰富碳源，有利于根际土壤微生物生长繁殖，提高土壤MBC、MBN。土壤呼吸以土壤微生物呼吸为主体[55]，受土壤温度、水分、施肥、C/N 等因素影响[56]。施氮能改变土壤呼吸强度且存在剂量效应[57]。与不施氮相比，施氮显著提升草地土壤呼吸强度[58]。施氮150 kg/hm2提高土壤呼吸强度，而施氮250 kg/hm2降低土壤呼吸强度[59]。本研究中，施氮显著提高粗齿冷水花根际土壤基础呼吸和基质诱导呼吸强度，根际土壤微生物活性增强，有利于粗齿冷水花根际土壤磷的矿化分解。可能是由于施氮增加土壤氮含量，降低土壤C/N 值，促进微生物分解更多土壤有机质，从而增加土壤有机质中碳的分解和释放，激发了土壤呼吸作用。施氮能提高粗齿冷水花根际微生物生物量碳、氮和呼吸强度，说明施氮能提升高磷环境下根际微生物生物量与活性，这可能是施氮后根际土壤磷有效化与植物磷富集能力提升的原因之一。

4 结论

不施氮时，粗齿冷水花的生长和磷积累能力在高磷处理下受到抑制。施氮可提高粗齿冷水花根际土壤磷酸酶、植酸酶和微生物活性，消除高磷抑制生长的现象，进而促进粗齿冷水花的磷积累，且对矿山生态型磷积累的提升作用更明显。