有机肥对煤矿复垦土壤团聚体碳氮磷含量及细菌群落的影响

孙晓东，栗海鹏，高文俊，张 杰，徐明岗，郝鲜俊*

（1 山西农业大学资源环境学院，山西太谷 030801；2 山西农业大学草业学院，山西太谷 030801）

土壤团聚体作为土壤结构的基本单元和微生物活动的重要场所，其数量和大小与土壤养分、微生物多样性密切相关[1-2]。土壤微生物是农田生态系统中的重要组成部分，对于调节能量流动和养分循环至关重要[3]。不同粒径的团聚体中养分不同，会影响团聚体中微生物的生长和繁殖[4]。反过来，微生物的生长代谢也可以对团聚体产生影响。微生物代谢产生的多糖类物质可以将微团聚体粘结，进一步被土壤中的菌根菌丝凝结成更稳定的大团聚体，同时微生物分泌的胞外酶也可以影响团聚体中碳氮磷的转化[5]。可见，土壤团聚体与微生物相互联系、相互影响、密不可分。然而，采煤塌陷区在进行工程复垦时由于对土地的扰动较大，土层上下翻动，使得复垦土壤结构被破坏，团聚体数量减少，土壤微生物活性降低，致使复垦土壤肥力低下，限制作物生长[6]。而畜禽有机肥具有来源广、肥效长、养分丰富等特点，利用畜禽粪便培肥土壤，尤其是低肥力的煤矿复垦土壤可以提高复垦土壤养分含量，改善土壤结构，对减施化肥，保护耕地资源具有重要意义。

大量研究表明，施用有机肥可以显著增加土壤中碳、氮、磷的含量，对土壤微生物结构和多样性造成影响[7-9]。Muhammad 等[7]在中国南方酸性水稻土上的研究表明，施用有机肥(牛粪)显著增加了土壤碳氮磷养分及有效性，同时提高了土壤氮素和磷素平衡性。张恩平等[8]通过研究施肥对番茄土壤中微生物的影响发现，施用有机肥(马粪)可提高土壤微生物群落功能多样性，其中香浓指数、丰富度指数、优势度指数均显著提高，而均匀度指数显著降低。安祥瑞等[9]在赤红壤上的研究发现，施用有机肥(羊粪)显著增加了土壤微生物丰富度和多样性，改变了土壤细菌群落，其中拟杆菌门、变形菌门、芽单胞菌门等丰度显著增加，绿弯菌门、酸杆菌门等丰度显著降低。

然而，关于土壤微生物对施肥响应的研究多集中在全土上，在团聚体水平上的研究较少。关于有机肥对团聚体的影响多为施用单一有机肥，针对不同有机肥对土壤团聚体及其碳氮磷养分和微生物学特性的影响研究较少，尤其是在复垦土壤这种低肥力土壤上的相关研究尚未见报道。因此，本研究基于复垦土壤定位培肥试验，以团聚体作为枢纽，将碳氮磷养分-团聚体-土壤微生物三者联系起来，探讨其相互关系和作用机理，旨在为合理培肥、改善复垦土壤微环境和提升土壤质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于山西省孝义市采煤塌陷复垦区(37°06′N, 111°37′E)，地处黄土丘陵区，属于暖温带大陆性季风气候，年平均气温为10.1℃，年均日照时长为2300 h，全年降雨量为470 mm 左右，主要集中在7—9 月，全年无霜期达170 天。试验地于2016年采用挖深垫浅、平整土地法进行工程复垦，供试土壤为石灰性褐土，质地为壤质黏土。复垦初始(2016 年) 0—20 cm 耕层土壤基本化学性质为：pH 8.43，有机质含量5.45 g/kg，全氮含量0.15 g/kg，速效磷含量4.34 mg/kg，速效钾含量85.9 mg/kg。

1.2 试验设计

定位培肥复垦试验始于2017 年，种植作物为春玉米，每年5 月播种，10 月收获，之后秸秆还田。本试验采用随机区组设计，试验共设5 个处理：不施肥对照(CK)、施化肥(CF)、施鸡粪(CHM)、施猪粪(PM)、施牛粪(CM)，每个处理设置3 个重复，共15 个小区，每个小区面积为30 m2(5 m×6 m)，小区间有宽为50 cm 的地垄，防止相邻小区间相互影响。化肥为尿素(N 46.4%)、过磷酸钙(P2O516%)、氯化钾(K2O 63%)；供试有机肥为腐熟的鸡粪、猪粪、牛粪，每年施用前测定基本理化性质，供试鸡粪、猪粪、牛粪各指标5 年的平均值分别为：pH 7.89、8.01、8.34，含水量21.1%、20.2%、35.9%，全氮17.1、15.2、11.5 g/kg，全磷17.9、21.3、15.9 g/kg，全钾10.6、8.76、8.68 g/kg，有机质216、166、144 g/kg。

有机肥施用量以P2O5100 kg/hm2为标准折算，为保证各小区氮、钾养分充足，氮、钾施用量分别为N 200 kg/hm2和K2O 100 kg/hm2，有机肥带入的N不足200 kg/hm2则用尿素补足，K2O 不足100 kg/hm2则用氯化钾补足(表1)。所有肥料均在玉米播种前一次性施入。

表1 有机肥施用量及带入的养分含量 (kg/hm2)Table 1 Manure application amount and the nutrient amount carried with manures

1.3 样品采集和测定

1.3.1 土壤样品采集 于2021 年玉米收获后采集0—20 cm 的耕层土壤。在每个小区按“S”形采集6～8 个点土样轻微混合，剥离因采样时挤压变形的土壤，同时去除植物、动物、石砾等土壤中的异物，沿自然裂缝掰成直径为1 cm 左右大小的土块，放入装有冰袋的硬质塑料盒中，确保运输途中不受挤压，送回实验室测定。

1.3.2 土壤团聚体分级 本试验团聚体分级采用鲜土干筛法，以减少因水泡对土壤微生物群落造成的影响[10]。将剔除过石砾、动植物残体等异物的新鲜土壤低温下适当风干后混合均匀，过8 mm 筛备用。每次称取低温风干过的鲜土100 g，置于套筛(2、0.25 mm)最上层，上下振动5 min，振幅为20 cm，振动频率60 次/min，即可分离出＞2 mm、0.25～2 mm、＜0.25 mm 粒径的团聚体。重复这一步骤多次，收集足够测样的土壤团聚体。将各粒径的团聚体取一部分风干，用于测定土壤团聚体碳氮磷养分，剩余另一部分鲜土用于测定团聚体中微生物量碳氮磷和细菌测序。

1.3.3 土壤团聚体养分测定 团聚体中养分含量测定参照《土壤农化分析》[11]：有机碳(SOC)含量采用重铬酸钾-容量法测定，全氮(TN)含量采用半微量凯氏滴定法测定，全磷(TP)和速效磷(AP)含量采用钼蓝比色法测定。

团聚体中微生物量碳(SMBC)、氮(SMBN)采用氯仿熏蒸—K2SO4浸提，TOC 仪(multi N/C®3100,Jena, Germany)测定，SMBC 和SMBN 的转换系数分别为0.45 和0.54[12]。团聚体中微生物量磷(SMBP)采用氯仿熏蒸—NaHCO3浸提，钼蓝比色法测定，SMBP的转换系数为0.4[13]。用未熏蒸土样滤液测定的结果即为可溶性有机碳(DOC)和可溶性总氮(TDN)。

1.3.4 DNA 提取和高通量测序 使用E.Z.N.A.®soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)试剂盒进行土壤团聚体微生物总DNA 提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量，NanoDrop 2000 进行DNA 浓度和纯度测定。使用338 F (5'-ACTCCTACGG GAGGCAGCAG-3')和806 R (5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3') 引物对16S rRNA 基因(V3～V4区)进行PCR 扩增。将同一样本的PCR 产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™ Fluorometer (Promega,USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit (Bioo Scientific，美国)进行建库。利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.3.5 PICRUSt 功能预测 首先通过PICRUSt 对OTU 丰度表进行标准化，去除16S marker gene 在物种基因组中的copy 数目的影响；然后通过每个OTU 对应的greengene id，获得OTU 对应的KEGG Ortholog (KO)信息，并计算各KO 丰度。根据KEGG数据库的信息，可以获得KO、Pathway 信息，并能根据OTU 丰度计算各功能类别的丰度。此外，针对Pathway，运用PICRUSt 可获得代谢通路的3 个水平信息，并分别得到各个水平的丰度表。

1.4 计算公式

土壤微生物与土壤资源之间的化学计量失衡(不平衡性)特征通过速效(可利用)养分计量比与微生物生物量养分计量比来计算，其值越小表示土壤碳氮磷平衡性越好[14-16]，具体计算公式如下：

1.5 数据处理

试验结果使用Microsoft Excel 2019 进行数据处理，使用IBM SPSS Statistics 22 软件，Pearson 法进行相关性分析，Duncan 法进行处理间差异显著性分析(P＜0.05)，单因素方差分析(one-way ANOVA)用于比较变量效应。利用上海美吉生物云平台进行细菌群落及多样性计算，并进行PICRUSt 功能预测和热图(Heatmap)分析。使用Canoco 5 软件进行主成分分析(PCA)，用Origin 2022 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对复垦土壤团聚体碳氮磷的影响

连续5 年定位培肥后，不同施肥处理对复垦土壤团聚体的分布产生了显著影响(表2)。各处理均以＞2 mm 的团聚体比例最大，占47.18%～63.95%，其次是0.25～2 mm 团聚体，占30.35%～44.39%，＜0.25 mm 团聚体所占比例最小，仅4.72%～6.61%。与CK 处理相比，施用化肥显著降低＞2 mm 团聚体比例，而对于其他两个粒径团聚体的分布无显著影响。而施用有机肥却增加了＞2 mm 团聚体的比例，降低了＜0.25 mm 团聚体的比例。与化肥相比，鸡粪、猪粪和牛粪均显著提高了＞2 mm 团聚体的比例，提高幅度分别为35.56%、22.32%和20.25%，显著降低了＜0.25 mm 团聚体的比例，分别降低了28.64%、12.22%和27.36%。

财务公司作为企业集团专业的产业型金融机构，不仅在产融结合方面拥有丰富的经验，同时也更加了解企业集团的产业特点以及所处地位，有利于开展科学地金融服务。财务公司能够对企业集团和各成员的财务活动情况进行全面分析，有效掌握相应的资金活动规律以及在产业链中潜在的风险，同时也能够有效反映企业集团运营管理存在的问题。财务公司能够凭借自身的专业优势来掌握企业集团上下游企业的金融服务需求，为各企业提供更合理的金融服务并降低相应成本。

表2 不同施肥处理下各粒径土壤团聚体的重量分布 (%)Table 2 Weight distribution of soil aggregates under different fertilizer treatments

连续5 年定位施肥显著增加了团聚体中碳、氮、磷养分含量，且有机肥的增幅大于化肥(表3)。与化肥处理相比，有机肥显著增加了团聚体中碳(SOC、DOC 和SMBC)含量50% (平均增幅)，氮(TN、TDN和SMBN) 含量15% (平均增幅)，磷(TP、AP 和SMBP)含量43% (平均增幅)。

表3 不同施肥处理下土壤团聚体的碳氮磷养分含量Table 3 The carbon, nitrogen and phosphorus contents of soil aggregates under different fertilizer treatments

有机肥对各粒径土壤团聚体中碳、氮、磷养分的提升幅度不同，具体表现为：对＞2 mm 团聚体中DOC 含量的提升幅度最大，平均达到42%，其中鸡粪、猪粪和牛粪较化肥分别显著增加了3 3%、70%和22%，且猪粪对DOC 的提升幅度比鸡粪和牛粪分别显著增加了28%和40%。有机肥对0.25～2 mm团聚体中TN、TP、SMBN 和SMBP 的提升幅度最大(分别为41%、73%、42%和260%)。并且，施肥对上述指标的提升效果均表现为鸡粪＞猪粪≥牛粪≥化肥，其中鸡粪较化肥处理显著增加了21% 的TN、22%的 TP、47% 的SMBN 和83.85%的SMBP。有机肥对＜0.25 mm 团聚体中SOC、AP 和SMBC 的提升最大(增幅分别为75%、373%和124%)。在该团聚体中，有机肥对SOC 和SMBC 的提升效果均表现为猪粪＞鸡粪≥牛粪。与鸡粪和牛粪相比，施用猪粪显著增加了SOC 含量(增幅分别为24%和23%)和SMBC 含量(增幅分别为23% 和21%)。然而，对SMBP 的提升效果则是以鸡粪最大，牛粪最小，鸡粪较牛粪显著增加了41%。

不同施肥下复垦土壤团聚体碳氮磷养分失衡情况存在显著差异(图1)，碳氮、碳磷和氮磷养分失衡值均在0.25～2 mm 团聚体中最低，分别为1.56～2.60、0.43～0.85 和0.18～0.29，说明碳氮磷养分在0.25～2 mm 团聚体中平衡性最好。与CK 处理相比，化肥对0.25～2 mm 团聚体中养分失衡度均无显著影响，而施用有机肥却显著降低了该团聚体中碳氮失衡和氮磷失衡度，分别降低了8%～33% 和12%～35%。同时，所有施肥处理均显著降低了该团聚体中的碳磷养分失衡度，降幅为31%～49%。

图1 不同施肥处理下复垦土壤团聚体碳氮磷养分失衡Fig.1 Imbalance of carbon, nitrogen and phosphorus in soil aggregates under different fertilizer treatments

2.2 不同施肥处理对复垦土壤团聚体细菌群落多样性的影响

本研究发现，0.25～2 mm 团聚体中碳氮磷养分平衡性较好(图1)，因此对0.25～2 mm 团聚体进行Illumina Miseq 高通量测序。

不同有机肥对复垦土壤团聚体细菌α 多样性的影响存在差异(图2)。Chao 指数可以反映物种的丰富度，其值越大表示样本的物种丰富度越高。与CK 处理相比，牛粪处理下Chao1 指数显著增加了8.5%，其他处理无显著增加。Shannon 指数可以反映物种的多样性，Pielou 指数用来反映物种的均匀程度，其值越大分别表明微生物群落多样性越高、物种分布越均匀。不同施肥对Shannon 指数和Pielou指数的影响呈现出相似的趋势，3 种有机肥处理较CK 处理均显著增加了Shannon 指数和Pielou 指数，增幅分别为2.5%～5.0% 和1.6%～4.6%，且其值大小均为鸡粪≥猪粪≥牛粪≥化肥≥CK。PD 指数(谱系多样性指数)可以反映样本中细菌物种谱系演化差异，其值越大表明物种谱系演化差异越大。与CK 处理相比，施肥均显著提高了PD 指数(4.2%～6.8%)。

图2 不同施肥处理下土壤团聚体中细菌多样性Fig.2 Bacteria diversity in soil aggregates under different fertilizer tratments

2.3 不同施肥处理对复垦土壤团聚体细菌群落组成的影响

在门水平上，相对丰度＞1%的细菌类群10 个，共占菌群比重94.8%～96.8% (图3)。其中优势细菌门(相对丰度排名前5)包括放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，这5 个菌门共占细菌总数的87.4%～89.2%。

图3 不同施肥处理下复垦土壤细菌门水平的相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacterial phylum levels in reclaimed soils under different fertilizer treatments

施肥显著影响复垦土壤细菌群落组成(图3)。与CK 处理相比，施肥后变形菌门和拟杆菌门的相对丰度分别增加了8.98%～43.5%和19.9%～56.0%。有机肥对上述细菌门的提升幅度比化肥更大，其中施鸡粪提升幅度最大，较化肥分别显著增加了26.6%和30.1%。施用化肥显著降低了13.1%芽单胞菌门的相对丰度。所有施肥处理均降低了酸杆菌门的相对丰度，降幅为17.8%～110.0%，其中鸡粪和猪粪处理降幅最大，分别为110.0%和92.6%。此外，牛粪处理较化肥显著增加了髌骨菌门(Patescibacteria)50.5%，其他处理无显著增加。不同有机肥对复垦土壤细菌群落的影响差异显著，与牛粪处理相比，施用鸡粪分别显著增加了变形菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门31.6%、28.6% 和14.5%。施用鸡粪较CK处理显著降低了绿弯菌门33.6%，其他处理与CK 无显著差异。

2.4 复垦土壤团聚体细菌群落功能预测

将16S rRNA 高通量测序结果与KEGG 数据库进行比对，结果(图4)显示，一级功能包括新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病和有机系统6 大类，其中新陈代谢功能为主要的一级功能，占78.92%～79.87%。与CK 处理相比，施肥均增加了新陈代谢功能的基因丰度(P＜0.05)，鸡粪和猪粪处理显著增加了环境信息处理功能，降低了遗传信息处理功能的基因丰度，只有鸡粪处理显著增加了细胞过程功能，其他处理对细胞过程功能无显著影响。

图4 不同施肥处理下土壤细菌一级功能基因相对丰度Fig.4 Relative abundance of primary functional genes in soil bacteria under different fertilizer treatments

基于KEGG 数据将上述一级代谢通路细分为二级功能层，预测结果(图5)表明，土壤细菌群落二级通路主要由全局和概览通路、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、膜转运等46 种子功能组成。其中前10 的丰度分别为全局和概览通路(40.33%～40.97%)、碳水化合物代谢(9.55%～9.92%)、氨基酸代谢(8.42%～8.48%)、能量代谢(4.29%～4.32%)、辅助因子和维生素代谢(4.06～4.11%)、膜转运(2.76%～3.00%)、翻译(2.50%～2.64%)、脂质代谢(2.34%～2.39%)、复制和修复(2.30%～2.35%)、核苷酸代谢(2.23%～2.28%)。与CK 处理相比，施肥增加了全局和概览通路、碳水化合物代谢和膜转运功能基因丰度，其中鸡粪处理提升最大。与CK 和化肥处理相比，3 种有机肥处理均降低了翻译和核苷酸代谢功能基因丰度。此外，鸡粪牛粪处理较CK 处理显著降低了辅助因子和维生素代谢功能基因丰度，其他处理无显著降低。

图5 不同肥料处理土壤细菌二级功能基因相对丰度(前10)Fig.5 Relative abundance of the secondary functional genes (top 10) in soil bacteria under different fertilizer treatments

经KEGG 数据库预测后共检测到67 个与碳代谢相关的直系同源基因(KO)，20 个与氮代谢相关的KO，50 个与磷代谢相关的KO (图6、图7、图8)。通过KO 聚类分析发现碳、氮代谢相关的基因均按照处理聚为两类，分别为鸡粪和其他处理。其他4 个处理，CK 和化肥聚为一类，猪粪和牛粪聚为一类。磷代谢相关基因则按照处理聚为两类，CK 和化肥为一类，有机肥处理为一类。施用有机肥显著增加了碳代谢相关基因丰度(图6)，包括有机物氧化作用基因(Bgl、Cl、Cbh、Pmoa、Pmob、bcrB等)、发酵功能基因(acdA、pta、porA)、甲烷产生功能基因(pmoa、pmob、pmoc等)，其中筛选出的有机物氧化作用相关基因最多。有机肥显著增加了氮代谢相关基因丰度(图7)，其中鸡粪处理增加最显著，包括固氮作用基因(nifK、nifH、nifD、anfG)、硝化作用基因(amoA、amoB、amoC)、反硝化作用基因(napA、napB、narH、narG、nirS、nirK等)，降低了氮异化还原功能基因(nirD)的相对丰度。3 种有机肥处理均显著增加了有机磷矿化基因(phnM、phnJ、phnP、phnI、olpA、phoA、phoD等)、无机磷溶解功能基因(gcd、ppx、ppa)和磷吸收功能基因(ugpQ、phnC、pstS、phnE、phnK、pit等)的相对丰度(图8)。此外，3 种有机肥对碳氮磷代谢功能相关基因的提升效果均表现为鸡粪＞猪粪≥牛粪。

图6 碳代谢KO 预测基因的相对丰度热图Fig.6 Heatmap of KO predicted genes related to carbon metabolism

图7 氮代谢KO 预测基因的相对丰度热图Fig.7 Heatmap of KO predicted genes related to nitrogen metabolism

图8 磷代谢KO 预测基因的相对丰度热图Fig.8 Heatmap of KO predicted genes related to phosphorus metabolism

3 讨论

3.1 有机肥处理显著提高复垦土壤团聚体碳氮磷含量

本研究结果表明，连续定位复垦5 年后，有机肥处理下团聚体中有机碳、全氮和速效磷含量(3.46～5.47 g/kg、0.42～0.53 g/kg 和7.12～10.97 mg/kg)与复垦初始土壤有机碳、全氮和速效磷含量(3.16 g/kg、0.15 g/kg 和4.34 mg/kg)相比均有明显提升，说明培肥措施(尤其施用有机肥)有利于新复垦地快速积累养分。此外，全量养分(SOC、TN、TP)、速效养分(DOC)和微生物量养分(SMBC、SMBN)含量在大团聚体中最高，微团聚体中最低(表3)，这与前人[17-18]的研究结果一致，说明大团聚体中含有更多的营养物质，可供微生物生命活动所需。而AP 和SMBP含量却在大团聚体中最低，在微团聚体中最高，可能是大团聚体中次生矿物对磷的吸附作用较强，很难被微生物获取，从而降低了有机磷矿化和微生物对磷的利用[19]。

本研究中，施肥显著增加了各粒径团聚体中的碳氮磷养分含量，有机肥的效果最明显，这与白娜玲等[20]在潴育型水稻土和荣勤雷等[21]在设施菜田上的研究结果一致。此外，先前的研究[22-23]表明，长期施用化肥使土壤微生物活性降低，微生物生物量减少。但本研究结果表明，所有施肥处理包括化肥均可以显著增加团聚体中微生物生物量，原因可能是本试验地为复垦地，土壤养分相对贫瘠，施用化肥使土壤中养分增加，以维持微生物生命活动所需[24]。本研究中猪粪处理下碳含量最高，而鸡粪处理下磷含量最高。其原因可能与伴随有机肥施入的有机碳的量及有机肥类型有关。在本试验定位施肥中，鸡粪、猪粪和牛粪连续5 年累计有机碳投入量分别为3980、4113 和3908 kg/hm2(表1)，数量差异不大，但由于猪粪中的有机质较鸡粪和牛粪更易于矿化分解[25]，其分解产生较多的溶解性有机质(DOM)供微生物直接利用[26]，因而施用猪粪土壤团聚体中有机碳含量提升较施用其他有机肥显著。鸡粪中的活性磷和中活性磷(NaOH-Pt、NaHCO3-Pt、核酸和磷酯类等)显著高于猪粪和牛粪[27]，这类磷移动性大，不易被吸附，这也许是导致施用鸡粪土壤磷有效性高的一个原因。牛粪处理对团聚体碳、氮、磷含量的提升效果均较小，因为牛粪中木质素含量高，不易分解，因此牛粪中的有机物矿化分解较慢，不利于微生物同化利用[28]。在本研究中，与CK 相比，有机肥处理均显著提高了土壤团聚体中氮含量，这与前人[3,6,21]研究结果一致，但有机肥与化肥之间以及不同有机肥之间土壤团聚体中氮含量差异较小，尤其是可溶性氮含量，可能与本研究中有机肥带入的氮含量较低，大部分氮由化肥补充提供有关。因此，关于不同有机肥对土壤团聚体氮含量的影响尚需进一步研究。

SMBC/SMBN 可以反映土壤的微生物结构，一般细菌的SMBC/SMBN 为5∶1，放线菌为6∶1，真菌为10∶1[29]。本研究中土壤SMBC/SMBN 为2～5 左右，说明土壤微生物以细菌为主。本研究结果表明，施肥可保持土壤团聚体中碳、氮、磷养分平衡，其中有机肥处理最显著，这与李宁[30]在农田土壤上的研究结果一致，表明施用有机肥可以促进微生物获取缺乏元素，保持土壤碳氮磷养分平衡。

3.2 有机肥改变复垦土壤团聚体细菌群落

本研究结果表明，施肥均显著增加了Shannon指数、Pielou 指数和PD 指数，这与杨叶华等[31]的研究结果一致，说明施加化肥可以显著增加复垦土壤中的养分(表3)，促进微生物吸收有效养分，从而增加微生物多样性。在本研究中放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和拟杆菌门为优势菌门(图3)，这与大多数的研究[32-34]结果一致。不同施肥处理对细菌门的影响存在差异，其中与CK 处理相比，施肥均显著降低了酸杆菌门的相对丰度，这是因为酸杆菌门极易富集在寡营养环境中，施肥显著增加了土壤中的养分状况，使土壤环境发生变化，因此酸杆菌门丰度降低[35]。与化肥处理相比，施用有机肥显著增加了芽单胞菌门的相对丰度，这与Li等[36]在新垦农田上的研究结果一致。芽单胞菌门属于固碳菌，施加有机肥可以极大地投入有机物料，为微生物生命活动提供底物，促进固碳微生物生长发育[37]。鸡粪处理显著降低了绿弯菌门的相对丰度，这是因为绿弯菌门属于典型的寡养菌，本研究中鸡粪处理对养分提升最显著(表3)，高营养的环境抑制了绿弯菌门的生长，因此其相对丰度降低。

3.3 不同有机肥处理下复垦土壤团聚体细菌功能差异

本研究中新陈代谢功能为主要的一级功能，并且施用有机肥增加了一级通路中新陈代谢和环境处理功能基因丰度(图4)，这与田夏琼等[38]的研究结果相似。说明施用有机肥为微生物生命活动提供了底物，增强了变形菌等微生物活动，使新陈代谢功能基因丰度增加。牛粪处理辅助因子和维生素代谢功能较低，这可能与牛的喂养有关，牛主要以饲草料或青贮谷物为食，其维生素含量较低[39]。练金山等[40]在潮土上研究的有机肥对细菌影响的结果表明，施用有机肥显著提高了化能异养和发酵作用的细菌种群丰度。本研究KEGG 二级功能预测也表明施用有机肥增加了碳水化合物代谢功能的基因丰度(图5)。有机肥的施入不仅增加了外源有机质还带入了微生物活性物质，增强了碳代谢功能，促进了有机质矿化，这可能也是土壤有机碳含量提高的原因之一。此外，施用有机肥增加了膜转运功能基因丰度，有利于作物从外界吸收营养物质或外排激素以维持营养平衡，调节生理功能[41]。在本研究中KEGG 三级功能预测结果表明，施用有机肥显著增加了碳、氮、磷代谢相关功能基因丰度(图6、图7、图8)。这是因为有机肥施入增加了土壤中的养分含量，富营养细菌增加，包括参与碳代谢的芽单胞菌、促进固氮的变形菌、具有溶磷能力的拟杆菌活性增强，进一步产生较多促进碳氮磷循环的酶，加速了土壤中碳氮磷养分循环，进而改善土壤质量[42]。

4 结论

1)连续5 年定位培肥后，施用有机肥显著改善复垦土壤结构，提高团聚体中碳氮磷养分含量，其中猪粪对碳含量的提升效果最大，鸡粪对磷含量的提升效果最大，3 种有机肥对可溶性氮含量的提升效果没有显著差异。

2) 施用有机肥显著增加了复垦土壤中变形菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门和粘菌门的相对丰度，并增加了碳氮磷代谢功能相关基因丰度，其中鸡粪处理增幅最大，表明鸡粪可促进土壤中碳氮磷养分循环，改善土壤质量。