氨基酸转运蛋白介导植物免疫研究进展

郭 楠，瞿红叶，高 菲，徐国华

（1 扬州大学园艺园林学院，江苏扬州 225009；2 南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 210095；3 作物遗传与种质创新利用全国重点实验室，江苏南京 210095）

氮是植物各项生命活动所必需的大量营养元素，在植物生长发育以及抗病中扮演着十分关键的角色。土壤中的无机氮(铵态氮、硝态氮)和较小分子的有机氮(氨基酸、小肽) 是植物主要的氮素来源。由于病原菌也需要获得氮素养分来维持自身生长和繁殖，因此氮素是植物-病原菌间相互作用的关键物质。前人已经总结对比了供铵或供硝处理对植物免疫的影响[1-2]，总体上来说，当活体营养型病原菌侵染植物时，外源添加硝态氮会降低植物的抗病性，而供铵能够提高植物的抗病性。当植物感染半活体营养型或死体营养型病原菌时，植物抗病性受植物种类、无机氮形态和浓度等多种因素的影响[1]。此外，参与无机氮吸收转运的转运蛋白，如拟南芥硝酸盐转运蛋白nitrate transporter 2.1 (AtNRT2.1)和AtNRT2.2 及铵态氮转运蛋白ammonium transporter 1.1 (AtAMT1.1) 等在植物抗病中也起到了重要作用[3-4]。

植物根系吸收的铵态氮和硝态氮主要分别在细胞质和质体中同化为氨基酸[5]。虽然根系吸收的硝态氮主要转移到地上部被还原为铵进而同化为氨基酸，但对大多数植物而言，氨基酸是氮素从源到库长距离运输的主要形式[6]。氨基酸作为蛋白质合成的前体物质，对植物根、叶、花、种子发育尤为重要，因此氨基酸运输系统是植物生长发育过程中的关键组成部分[7]。近年来，氨基酸及氨基酸转运蛋白在植物免疫中的作用也引起研究人员的关注。本文重点聚焦氨基酸积累和运输对植物免疫的影响，总结了氨基酸转运蛋白在植物抗病中的作用，探讨了氨基酸运输分配调控植物-病原菌互作的机制。

1 氨基酸稳态在植物免疫中的作用

病原菌常常从植物中获取氨基酸以满足自身生长繁殖，病原菌和宿主植物间的氨基酸动态平衡直接影响了植物的抗病性[8]。当植物遭遇病原菌入侵时，病原菌在宿主植物的质外体中快速繁殖，此时，宿主植物一方面通过转移营养物质来饿死病原菌，另一方面激活体内的防御反应，如大量积累活性氧，释放信号提醒未遭到侵染的组织细胞，抑制病原菌的生长[9]。病原菌和宿主植物对氮营养的竞争是一个复杂的过程，病原菌能否成功入侵宿主，既取决于病原菌利用植物组织中的氮形态、氮转运和氮代谢的能力，又与宿主细胞对其防御能力有关[10-11]。在防御过程中，植物约释放出15% 同化后的氮营养，且主要是以氨基酸的形式[12]。有研究发现，硝酸盐缺陷型褐孢霉(Cladiosporumfulvum)或稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)仍具有致病性[13-14]，而甲硫氨酸缺陷型稻瘟病菌和精氨酸缺陷型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporium)则不具有致病性[15-16]，说明病原菌侵染植物过程中，病原菌的生长更依赖于宿主植物提供的氨基酸态氮，而非硝态氮。

病原菌的化学感受器能够识别多种氨基酸，并将微生物引导至宿主植物营养充足的组织中，因此某些特定氨基酸稳态影响了植物和病原菌之间的共生关系[17]。植物能够检测其体内的氨基酸水平，并将氨基酸代谢、局部氨基酸浓度变化、氨基酸跨膜运输等活动视为遭到病原菌入侵的表现[18]。通常感染病原菌的局部植物组织中氨基酸浓度升高，比如当猕猴桃感染丁香假单胞菌后(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)，被侵染叶片中精氨酸和谷氨酰胺含量出现持续性增加，碳氮代谢途径均发生变化[19]。韧皮部杆菌侵染柑橘后导致柑橘出现黄龙病，黄龙病是生产上的毁灭性病害，又叫做“柑橘艾滋”。抗病能力强的柑橘韧皮部汁液中色氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸含量明显高于易感病植株[20]。脯氨酸作为一种自由基清除剂，能够调节植物细胞氧化还原稳态，参与植物对生物胁迫的防御反应[21]。拟南芥感染丁香假单胞菌后(Pseudomonassyringaepv.tomato)，叶片中脯氨酸含量显著增加[22]。同时病原菌，如假单胞杆菌属细菌(Pseudomonas)，也常常进化为能够高效利用植物感染组织中丰度高的氨基酸组分，而选择性地丢失同化利用丰度较低的那类氨基酸的基因[23-24]，说明寄主植物组织中高浓度的氨基酸既是病原菌重要的养分来源，又是植物感染病原菌后的反应之一。

氨基酸合成和代谢在植物应对生物胁迫中同样发挥着重要作用，半胱氨酸在细胞不同区室中的代谢能够诱导不同的植物免疫反应，促进线粒体中半胱氨酸降解或抑制细胞质中半胱氨酸降解均能够增强植物的抗病性。半胱氨酸脱硫酶能够催化半胱氨酸脱硫生成丙氨酸和硫，在拟南芥中过量表达线粒体半胱氨酸脱硫酶(nitrogenfixations-like1,NFS1)后，植株体内抗性相关基因表达上调，转基因植物对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)的抗性显著增加[25]。相反，细胞质半胱氨酸脱硫酶(cytosolicdesulfhydrase1,DES1)突变后增强了植物的抗病性[26]。此外，有些氨基酸代谢或转运相关蛋白功能缺失虽然改变植物细胞中的氨基酸稳态，但没有激活植物免疫反应[27]。即使是在已经产生防御反应的植物体内，某些特定的氨基酸浓度也不会持续地表现出相同的变化，所以植物细胞中局部氨基酸水平变化可能是触发免疫反应的关键。

外源添加游离氨基酸也能够触发植物免疫反应。谷氨酰胺处理水稻根系后，参与水稻抗病的转录因子基因，如dehydration-responsiveelementbindingprotein1A(DREB1A)、bHLH(basichelix-loophelix)、noapicalmeristemprotein5(NAC5)等表达上调[28]。谷氨酸处理水稻根系后，根系和叶片中与抗病相关的基因同样被激活表达[29]。

氨基酸既是病原体的营养来源，又是植物体内氮的主要运输形式。氨基酸转运过程需要与特定受体结合，这些受体可能参与寄主植物与微生物相互作用时氨基酸运输和信号传导等过程。因此，了解氨基酸转运、解析氨基酸转运驱动植物-微生物间相互作用的分子机制至关重要。

2 氨基酸转运蛋白在植物免疫中的作用

氨基酸在植物细胞内和细胞间跨膜运输由定位在膜系统上的氨基酸转运蛋白(AATs)负责[30]。植物中编码氨基酸转运蛋白的基因达一百多个，在植物进化过程中，由于基因复制，植物转运蛋白家族成员的数量越来越多。不同植物氨基酸转运蛋白的氨基酸序列较为保守，物种间同源基因之间的同源性可高达98%[31-32]。氨基酸转运蛋白家族包括2 个亚家族，分别是氨基酸/生长素通透酶家族(amino acid transporter family, AAAP)和氨基酸-多胺-胆碱家族(amino acid polyamine organocation family，APC)[32]。此外多种酸进出转运蛋白家族(usually multiple acids move in and out transporter family, UMAMIT)介导植物体内氨基酸的外排，在氨基酸转运过程中也起到了重要作用[33]。迄今为止，在模式植物拟南芥中，约20%编码氨基酸转运蛋白的基因功能初步得到解析[27, 34]。

病原体以植物体内氨基酸为食，氨基酸在植物与病原体相互作用中发挥着重要作用。从节约能量的角度来说，病原体更倾向于直接获取和代谢植物体内的氨基酸，因此病原体可以直接诱导或激活氨基酸转运蛋白基因表达[34]。目前已报道的参与植物抗病的转运蛋白主要有AAAP 亚家族中的氨基酸透性酶子家族(amino acid permeases, AAPs)和赖氨酸组氨酸转运蛋白子家族(lysine and histidine transporters,LHTs)、APC 亚家族中的阳离子氨基酸转运蛋白子家族(cationic amino acid transporters，CATs)以及UMAMITs 家族(表1)。

表1 氨基酸转运蛋白在植物防御生物胁迫中的作用Table 1 Roles of amino acid transporters in plant immunity to pathogenic attack

2.1 氨基酸透性酶家族(AAPs)

植物中第一个被报道的氨基酸转运蛋白就是AAPs家族基因编码的[44]。AAPs参与植物氨基酸根系吸收、木质部装载、韧皮部装载、木质部和韧皮部间交换以及种子装载等过程，影响植物根、茎、叶的生长发育[30]。拟南芥中有8 个AAP基因，在AAPs家族中，AtAAP1 和AtAAP5 负责根系氨基酸的吸收[45-46]。AtAAP2 在韧皮部表达，影响氨基酸从木质部进入到韧皮部。AtAAP2 功能缺失后，突变体植株韧皮部中的氨基酸以及库中的氨基酸含量均显著减少，导致种子中的蛋白质含量下降[47]。AtAAP6 定位在木质部薄壁细胞，影响了木质部和韧皮部间氨基酸的交换[48]。而AtAAP8 负责韧皮部装载，并将氨基酸运至胚乳中，在种子发育过程中起到重要作用[49-50]。此外，AAPs 家族基因表达还受到病原菌侵染的诱导。胞囊线虫(Heteroderaschachtii)侵染拟南芥时，线虫能够将寄主植物的根细胞转化为一个合胞体，合胞体是线虫整个生命周期中唯一的营养来源。此时，植物在侵染部位周围会进化出防御机制来干扰合胞体的形成。在这个过程中，除了AtAAP5和AtAAP7，其他6 个AtAAPs基因在合胞体中均被诱导表达。此外，AtAAP1、AtAAP2、AtAAP8突变体合胞体中氨基酸转运紊乱，雌性线虫的繁殖受到明显抑制，说明氨基酸稳态对线虫的生长发育起到至关重要的作用[35]。当根结线虫(Meloidogyneincognita)侵染拟南芥植株时，AtAAP3和AtAAP6突变后，植株根中线虫侵染程度显著下降，线虫繁殖受到抑制，突变体植株抗病性增强，说明由AAP3和AAP6介导的氨基酸转运在线虫侵染和繁殖过程中均起到重要作用[36]。

值得注意的是，当病原菌入侵时，植物根系不同细胞中氨基酸转运蛋白呈现出不同的表达模式。近期一项研究发现，半活体营养型卵菌(Phytophthora parasitica)侵染拟南芥后，AtAAP3和AtAAP5在根系中柱组织表达上调，AtAAP6在根系皮层和中柱表达上调。而当半活体营养型病菌(Verticilliumlongisporum)侵染拟南芥后，拟南芥根系皮层中仅有AtAAP4表达受到诱导，而皮层细胞中AtAAP1和根表皮细胞中的AtAAP2的表达则受到抑制[51]。活体营养型卵菌(Pseudoperonosporacubensis)能够引发黄瓜霜霉病，转录组结合QTL 精细定位挖掘出黄瓜CsAAP2A基因是感病的关键候选基因。CsAAP2A功能缺失后，突变体植株叶片氨基酸含量较野生型显著下降，突变体抗病性增强。此外，敲除CsAAP2A在番茄中的同源基因SlAAP5A/SlAAP5B后，突变体植株的抗病性也增强了[37]，说明AAP家族基因在不同植物中均可以通过影响氨基酸转运进而影响植物的抗病性，其功能具有一定的保守性。

AAPs是植物防御机制中的负调节因子，一方面AAPs高表达时降低植物的免疫反应，使植物处于易感病状态；另一方面病原菌可能通过诱导AAPs基因的表达，改变植物体内游离氨基酸稳态，使感染病原菌的叶片中氨基酸含量增加，为病原菌提供充足的营养物质以满足其生长需求。病原菌对植物氨基酸转运蛋白的调控较为复杂，在后续研究中需要考虑到因局部细胞中基因表达差异而导致的氨基酸稳态出现的变化。

2.2 赖氨酸组氨酸转运蛋白家族 (LHTs)

LHTs 家族因被报道转运赖氨酸和组氨酸而得名，随后的研究发现其与AAPs家族基因类似，底物具有非特异性，能够转运绝大多数的氨基酸[52-54]。拟南芥AtLHTs家族基因共有10 个，其中AtLHT1 是该家族中首个功能被解析的转运蛋白[52]。AtLHT1 是一个高亲和转运蛋白，负责中性和酸性氨基酸的吸收转运[53]。AtLHT1 参与植物根系氨基酸的吸收，并将氨基酸运输至叶肉细胞中，功能缺失后导致拟南芥植株矮小，生物量下降，抗病性增强[38,53]。

大多数活体营养型病原体以植物组织质外体中的氨基酸为主要营养来源，当拟南芥感染活体营养型或半活体营养型病原体时，AtLHT1基因表达上调[38,51]。病原菌自身能够通过改变植物基因表达来获得其生长繁殖所需要的营养物质[55]。因此，当植物感染病原菌时，植物氨基酸转运蛋白表达变化可能是病原菌和植物体内氨基酸稳态共同作用的结果。从植物的角度来说，AtLHT1基因表达上调后，氨基酸大量进入叶肉细胞中，导致被感染的叶片质外体中的氨基酸含量下降，病原菌可获得的养分减少，最终达到饿死病原菌的目的。但是试验结果与推测相反，AtLHT1 在植物免疫反应中是一个负调节因子，Atlht1突变体对细菌(Pseudomonassyringae)和真菌(Colletotrichumhigginsianum，Erysiphecichoracearum)的抗性是增强的[38]。研究人员推测当病原菌侵染拟南芥时，AtLHT1功能缺失导致拟南芥细胞中谷氨酰胺含量下降，影响细胞氧化还原稳态，细胞中活性氧大量积累，诱导细胞程序性死亡。同时植物叶片中参与水杨酸介导的免疫反应途径的关键基因PR1(pathogenesis-relatedprotein1)表达上调，组织中水杨酸含量增加，从而触发防御机制，导致突变体植株表现出较强的抗病性(图1)[38]。在感染过程中观察到AtLHT1表达量增加，这个病原菌触发AtLHT1表达的响应过程被推测为植物抑制水杨酸介导的免疫途径[38]。

死体营养型生物感染植物后，是从死的寄主组织中获取养分。根据寄生的特性又分为两种情况：一种像活体营养生物一样，侵染活的细胞和组织，但寄主组织死亡后，能继续生长、繁殖；另一种是在侵入前先分泌酶或毒素杀死寄主组织，然后进人其中腐生[56]。植物抵御死体营养型病原体主要是通过乙烯/茉莉酸(ET/JA)途径[57-58]。研究发现，草莓果实感染死体营养型真菌(Botrytiscinerea)后，LHT1同源基因表达上调[59]。值得注意的是，拟南芥Atlht1突变体对死体营养型病原菌(Sclerotiniasclerotiorum)的防御能力与野生型相比没有差异[38]。AtLHT1 除了能够转运氨基酸，还可以转运乙烯合成的前体物质1-氨基环丙烷羧酸(ACC)[60]。当死体营养型病原菌感染寄主植物时，LHT1基因表达上调，植物激活免疫反应，通过影响植物体内ACC 水平，激活乙烯介导的抗病途径，从而激活了植物感染死体营养型病原菌后的免疫反应(图1)。

近几年，水稻、杨树、人参等植物LHTs家族基因的功能也已陆续被报道[54,61-62]。其中，单子叶模式植物水稻OsLHT1 不仅直接负责根系对氨基酸的吸收，参与氨基酸从根系往地上部转运以及叶片往穗中的转运过程，影响水稻的生长发育和产量，而且介导水稻对稻瘟病的抗性[39,54,63]。当稻瘟病病原菌(Magnaportheoryzae)侵染水稻叶片时，OsLHT1基因表达上调，叶片中氨基酸浓度下降，植物通过降低叶片中氨基酸水平触发植物防御反应。当OsLHT1功能缺失后，突变体植株体内氨基酸转运和黄酮类物质代谢紊乱，活性氧大量积累，同时水杨酸和茉莉酸介导的植物防御反应均被激活，叶片中水杨酸和茉莉酸含量增加，突变体植株表现出较强的抗病性[39]。有意思的是，Oslht1突变体叶片中水杨酸和茉莉酸含量变化趋势是不同的。当水稻未感染稻瘟病时，Oslht1突变体叶片中水杨酸和茉莉酸含量均显著高于野生型，而当寄主植物感染稻瘟病8 h 后，突变体叶片中水杨酸的含量仍然很高，但茉莉酸含量显著下降，甚至低于野生型，说明OsLHT1 介导水稻抗病性是水杨酸和茉莉酸途径的共同作用。在稻瘟病原菌入侵前，与野生型相比，Oslht1突变体叶片中的活性氧、水杨酸、茉莉酸含量均显著提高，而当病原菌入侵时，其感染过程将被抑制，因此该突变体植株表现出较强的抗病性(图1)[39]。基于此，我们推测水稻OsLHT1 可能同样影响了水稻其他的生物和非生物胁迫过程。与AAP 家族基因类似，植物LHT1 也作为抗病的负调控因子，通过影响水杨酸、茉莉酸途径影响植物免疫反应。

2.3 阳离子氨基酸转运蛋白家族(CATs)

拟南芥AtCAT1 是一个高亲和氨基酸转运蛋白，负责植物细胞中碱性氨基酸的运输，同时参与植物抗病。过量表达AtCAT1导致拟南芥生物量下降，但花期提前。当拟南芥感染半活体营养型病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)后，AtCAT1基因表达上调。与野生型相比，AtCAT1过表达转基因植株叶片中病程相关基因(PR1)表达量增加，水杨酸含量也显著提高，说明AtCAT1 通过影响植物体内水杨酸代谢通路进而影响植物的抗病性，且AtCAT1 在植物免疫反应中是一个正调控因子[40]。考虑到AtCAT1表达对病原菌侵染的反应较为迅速，它可能参与了植物的系统性抗性。

2.4 多种酸进出转运蛋白家族(UMAMITs)

UMAMITs 家族属于Nodulin-like 基因家族，早期研究认为UMAMITs 只在豆科等结瘤植物中存在，随后有研究发现在非结瘤植物基因组中也存在该基因家族的同源基因，且多个UMAMITs 被报道具有转运氨基酸的功能。拟南芥AtUMAMITs 作为一个氨基酸外排的转运体，主要参与植物体内氨基酸从韧皮部到种子的运输[65-67]。AtUMAMIT14 负责将根系韧皮部中的氨基酸外排到其他组织，在根系分泌氨基酸的过程中发挥着重要作用[67]。此外，AtUMAMIT14 是植物抗病的正调控因子，AtUMAMIT14过量表达改变了植物体内氨基酸稳态，通过影响水杨酸代谢途径，增强了拟南芥对卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis) 的抗性[41]。WAT1基因是紫花苜蓿Nodulin21的同源基因，后被鉴定为UMAMITs 家族基因[68]。WAT1 参与植物次生细胞壁沉积过程[42-43]。由细菌或真菌特异性侵染植物的维管系统导致植物出现维管束病害，从而影响植物生长发育。常见的维管束病害主要有由Xanthomonasoryzaepv.oryzae引起的水稻白叶枯病，由Xanthomonascampestrispv.campestris引起的十字花科黑腐病、Ralstoniasolanacearum引起的青枯病，由Verticilliumdahliae引起的棉花黄萎病等。拟南芥和番茄wat1突变体植株对多种维管束病原菌均表现出较强的抗性(表1)[42-43]。

3 总结和展望

氮素营养状况介导植物对病原体的防御机制十分复杂，受多种因素影响，如土壤氮库的组分、土壤氮的生物有效性、植物吸收利用氮的能力、病原菌的侵染特征、以及植物-病原菌间的相互作用等。在复杂的生长环境中，植物需要整合土壤和气候环境信息和自身氮营养状态，在病原菌初次侵染时，能够触发适当的免疫反应。氨基酸是植物初级代谢中蛋白质、能量和氮代谢的核心组分，它们是植物-微生物相互作用中具有特定功能的代谢物的前体，但其参与植物抗病的生理生化过程以及分子调控网络还有待深入解析。

本文总结了氨基酸转运蛋白家族基因在植物免疫反应和抗病中的作用，分析了其响应和调控机制。未来研究需要重点解析：1) 哪些氨基酸是植物防御机制的关键营养或信号物质；2) 病原菌侵染植物后，植物体内氨基酸信号的传导过程；3) 植物氨基酸转运蛋白如何识别病原菌；4) 植物氨基酸转运蛋白如何调节植物和病原菌间的营养竞争和资源分配；5) 氨基酸转运蛋白如何调控水杨酸/茉莉酸途径参与植物抗病；6) 植物-微生物间基因是否存在串扰等一系列问题。此外，目前已有的研究多集中在模式植物拟南芥中，而重要农作物的研究远远落后于模式植物，未来需要考虑如何将研究过渡到农作物中，使理论研究和生产实践更好地相结合。

虽然植物氨基酸转运蛋白突变体或过表达植株具有较强的抗病能力，但是这些转基因或基因编辑的植株矮小，生长受到抑制。在植物中，高产、优质、抗病往往是“不可能三角”，植物免疫反应中组织细胞中激素的协同或拮抗作用往往对其生长发育产生负面影响[69]。而这三者间的平衡既取决于植物内在的调控机制，也取决于外部的环境条件。基于现有的研究结果，我们可以推断氨基酸是偶联植物营养和植物免疫的关键物质，探索植物氨基酸运输机制及其在植物-微生物相互作用中的调控，将是连接植物初生代谢和生物胁迫信号传导的核心。通过解析介导植物抗病的关键氨基酸转运蛋白，挖掘优良的等位基因，利用基因编辑定向改良植物，或者通过分子设计育种，定向聚合控制产量、品质和抗病的优异单倍型，以期最大程度避免“不可能三角”的负面影响，可以为培育兼顾高产、优质和抗病的理想品种提供理论指导。