血清微RNA-34a在多发性骨髓瘤中的表达及其临床意义

冯丽倩，王友君，李栋梁，李卿，潘志兰

作者单位：石家庄市人民医院，a血液内科，b老年医学科，河北 石家庄 050000

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种血液系统恶性肿瘤，占所有血液系统恶性肿瘤约10%［1］。MM 临床表现多样化，包括不同程度的贫血、骨痛、高钙血症、肾损害等［2］。该病早期误诊率高，确诊时多处于中晚期，临床多采用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等联合治疗，近年来以硼替佐米为基础的化疗方案在临床被广泛应用，能提高近期疗效和生存率，但有部分病人疗效较差［3］，严重影响预后。因此，临床上需要寻找影响MM 化疗效果的因素，以便指导临床干预，进一步改善预后。近年来，越来越多的研究开始关注微RNA（microRNA，miRNA）在肿瘤中的作用，发现miRNA 与肿瘤的发生、发展及肿瘤的耐药等有一定的关系［4-6］。miRNA是一类对基因的转录、翻译、分子的编码代谢等过程具有调控作用的微RNA，miRNA-34a（miR-34a）是miRNA 家族中的一员，有研究发现，miR-34a 在肺癌、肝癌等恶性肿瘤中表达异常，与恶性肿瘤的发生、进展、预后密切相关［7-8］，但miR-34a 在MM 中的表达水平及其与化疗效果的关系尚少有研究报道。鉴于此，本研究检测miR-34a 在初诊MM 病人中的表达水平，探讨其与MM 病人化疗效果的关系，旨在为临床指导提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取石家庄市人民医院2017 年3月至2021 年5 月收治的102 例初诊MM 病人作为疾病组，另同期选取100例性别、年龄匹配的健康体检者作为对照组。纳入标准：疾病组均为新诊断的MM，均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南》［9］中的诊断标准；疾病组均采用以硼替佐米为基础的化疗方案进行治疗；对照组经体检均确认健康；受试者均签署知情同意书。排除标准：既往有化疗、放疗及其他肿瘤治疗史者；精神、认知功能异常者；合并白血病等其他血液疾病者；合并肝、肾、脑等脏器严重损害者；合并其他恶性肿瘤者。对照组男51 例，女49 例；年龄范围为46～72 岁，年龄（63.54±11.67）岁。疾病组男52例，女50例；年龄范围为47～74岁，年龄（62.59±14.35）岁；免疫分型：免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）型59 例、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）型21 例、轻链型17 例、其他类型5 例；国际分期系统（international staging system，ISS）分期：Ⅱ期24 例、Ⅲ期78 例；修订版国际分期系统（revised international staging system，R-ISS）分期：Ⅱ期56 例、Ⅲ期46 例；FISH 筛查结果：p53 缺失/突变21例、1q21 扩增49 例、t（4；14）18 例、t（14；16）5 例、t（14；20）2 例、t（11；14）13 例。两组性别、年龄比较，均差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 血清指标检测血清miR-34a 的检测对照组于体检当天、疾病组于入院后第2 天采集5mL 空腹静脉血，离心后提取血清，于-80 ℃超低温保存，委托德诺瑞尔生物科技有限公司检测血清miR-34a 表达水平：采用Trizol 试剂盒（美国Invitorgen 公司）提取血清总RNA，选用FQD-96A 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪进行逆转录成cDNA。反应条件：95 ℃变性35 s，60 ℃退火30 s，循环40 次，70 ℃延伸10 s。用2-ΔΔCt计算miR-34a 的相对表达量，其中引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

另采用BC-1800血常规检测仪检测疾病组血红蛋白水平，采用LX20 全自动血生化分析仪检测疾病组血钙和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。

1.3 化疗方法采用以硼替佐米为基础的化疗方案，包括PTD、PAD、RVD 方案。PTD 方案：硼替佐米（江苏豪森药业集团有限公司，批号H20173306）1.3mg/m2，于第l、4、8、11天静脉注射；地塞米松（河南科伦药业有限公司，批号H41023597）40 mg，于第1、2、4、5、8、9、11、12 天静脉注射；沙利度胺（常州制药厂有限公司，批号H32026129）100 mg/d，每晚睡前口服。PAD 方案：硼替佐米和地塞米松用法用量同PTD 方案，多柔比星（常州金远药业制造有限公司，批号H20123273）9 mg/m2，于第1～4 天静脉滴注。RVD：硼替佐米和地塞米松用法用量同PTD 方案；来那度胺（正大天晴药业集团股份有限公司，批号H20193006）25 mg/d，每晚睡前口服。21 d 为1 个治疗周期，连续治疗4个周期。

1.4 疾病组化疗效果判定化疗4 个周期结束后，参照国际骨髓瘤工作组制定的疗效标准对各种化疗方案效果进行评价，包括完全缓解、非常好的部分缓解、部分缓解、疾病稳定、疾病进展。统计化疗有效率，总有效率=完全缓解率+非常好的部分缓解率+部分缓解率。

1.5 多发性骨髓瘤病人血清miR-34a 水平与化疗效果的关系分析收集病人的临床资料，包括性别、年龄、免疫分型、ISS分期、R-ISS分期、血红蛋白、血钙、LDH 水平、荧光原位杂交（FISH）筛查有无细胞遗传学高危［参照mSMART 分层系统将合并p53缺失/突变、1q21 扩增、t（4；14）、t（14；16）、t（14；20）定义为高危，将合并t（6；14）、t（11；14）或无异常定义为非高危［10］］、血清miR-34a 表达水平等。将其作为自变量，将MM 病人化疗效果记为因变量，分析自变量与因变量的关系，其中变量赋值结果见表2。

表2 多发性骨髓瘤病人变量赋值

1.6 统计学方法采用SPSS24.0软件检验，计量资料若不符合正态分布则采用中位数（第25、75 百分位数），即M（P25，P75）描述，采用非参数秩和检验；计量资料若符合正态分布，以±s描述，两组比较采用t检验，多样本比较采用单因素方差分析和SNKq检验；计数资料用例（%）描述，采用χ2检验；采用logistic 多元回归分析法分析探讨血清miR-34a 表达水平与疾病组化疗效果的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疾病组与对照组血清miR-34a 表达水平比较疾病组血清miR-34a 水平低于对照组，差异有统计学意义（0.63±0.10 比1.45±0.23，t=32.97，P＜0.05）。

2.2 疾病组不同临床病理特征病人miR-34a 表达水平比较疾病组中ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、免疫分型IgG 型、FISH 筛查高危病人血清miR-34a 表达水平均低于ISS 分期Ⅱ期、R-ISS 分期Ⅱ期、免疫分型IgA、轻链型和其他类型、FISH 筛查非高危病人（P＜0.05）。见表3。

表3 多发性骨髓瘤不同临床病理特征病人miR-34a表达水平比较/± s

表3 多发性骨髓瘤不同临床病理特征病人miR-34a表达水平比较/± s

注：ISS为国际分期系统，R-ISS为修订版国际分期系统，FISH 为荧光原位杂交。

临床病例特征性别例数miR-34a t（F）值1.82 P值0.071男女年龄52 50 0.65±0.12 0.61±0.10 0.86 0.389≤60岁＞60岁免疫分型40 62 0.64±0.12 0.62±0.11（7.37）＜0.001 IgG IgA轻链型其他ISS分期59 21 17 5 0.59±0.08 0.69±0.13 0.68±0.12 0.68±0.12 4.96＜0.001Ⅱ期Ⅲ期R-ISS分期24 78 0.72±0.14 0.60±0.09 3.16 0.002Ⅱ期Ⅲ期FISH筛查56 46 0.66±0.12 0.59±0.10 2.90 0.005非高危高危26 76 0.69±0.15 0.61±0.11

2.3 疾病组血清miR-34a 表达水平与化疗效果的关系分析疾病组中分别有49 例接受PTD 化疗方案、29 例接受PAD 化疗方案、27 例接受RVD 化疗方案，化疗4 个周期后总有效率为75.49%（77/102），其中PTD、PAD、RVD 化疗方案总有效率分别为69.39%（34/49）、75.00%（21/28）、88.88%（22/25）。疾病组化疗无效组和化疗有效组性别、年龄、免疫分型、LDH 水平和治疗方案比较差异无统计学意义（P＞0.05）；化疗无效病人血红蛋白水平、血清miR-34a 水平低于化疗有效病人（P＜0.05），血钙水平和ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、FISH 筛查高危占比均高于化疗有效病人（P＜0.05）。见表4。

表4 多发性骨髓瘤病人化疗无效组和化疗有效组一般资料比较

将表4 中统计学检验P＜0.10 的变量纳入到logistic 回归分析模型中，模型0 为未校正任何变量，模型1为校正ISS分期和R-ISS分期，模型2在模型1基础上校正血红蛋白、血钙水平和FISH筛查高危比例。结果显示，在未调整任何因素下MM 病人血清miR-34a 水平降低化疗无效危险是正常水平病人的4.575 倍（P＜0.05），在全因素校正后是1.933 倍（P＜0.05）。见表5。

表5 多发性骨髓瘤病人多因素logistic回归分析

3 讨论

MM 是一种浆细胞恶性肿瘤，其主要由于浆细胞的无限增殖，从而导致多器官、组织损害等临床症状，且因其存在多因素性、多基因性及临床症状繁多等特性，易出现误诊、导致诊断率不高，故确诊时常处于中晚期［11］。目前临床针对MM 常采用以硼替佐米为基础的化疗方案进行治疗，虽明显提高了病人的生存率和完全缓解率，仍有不少病人化疗效果不佳，预后较差［12］。因此，需要探讨影响初诊MM病人化疗效果的相关因素，以提高化疗疗效，改善病人预后。

本研究结果显示，疾病组血清miR-34a 表达水平低于对照组，说明初诊MM 病人血清miR-34a 表达水平异常降低，提示血清miR-34a 可能参与MM的发生。miRNA 对基因具有调控作用，miRNA 功能失调或表达失调在多种疾病中发挥重要作用，特别是在肿瘤疾病中可作为抑癌基因或促癌基因参与肿瘤的发生发展过程［13］。郝志明等［14］报道miR-34a在胰腺癌中表达降低，这与本研究结果一致，均证实了miR-34a 与肿瘤的发生有关。本研究还发现，疾病组中ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、免疫分型IgG 型、FISH 筛查高危病人血清miR-34a 表达水平均低于ISS 分期Ⅱ期、R-ISS 分期Ⅱ期、免疫分型IgA、轻链型和其他类型、FISH 筛查非高危病人，表明血清miR-34a 表达水平与MM 临床病理特征有一定的关系，可能在肿瘤进展过程中具有重要意义。在MM 中，致癌基因突变和免疫球蛋白重链易位激活相关致癌基因被认为是MM 发生的重要机制。p53 是一种对肿瘤具有抑制作用的转录因子，能够诱导修复基因表达，在基因复制错误时阻止细胞周期，清除癌细胞。相关研究［15］报道，miR-34可与p53启动子区域结合，抑制促癌基因MYC蛋白和细胞周期蛋白依赖性磷酸化酶的表达，进而影响MM 的发生、发展。

本研究观察以硼替佐米为基础的化疗方案对初诊MM 的疗效，发现化疗4 个周期后总有效率为75.49%，其中PTD、PAD、RVD 化疗方案总有效率分别为69.39%、75.00、88.88%，与杨宁等［16］报道结果相近，提示仍有部分初诊MM 病人化疗效果差。本研究发现化疗无效病人血红蛋白水平、血清miR-34a 水平低于化疗有效病人，血钙水平和ISS 分期Ⅲ期、R-ISS 分期Ⅲ期、FISH 筛查高危占比均高于化疗有效病人，提示以上指标均与MM 病人化疗效果密切相关。由于骨髓瘤细胞恶性增殖、浸润骨髓破坏红细胞生成，导致血红蛋白水平降低，相关研究［17-18］报道，MM 病人血红蛋白水平与骨髓瘤细胞浸润骨髓程度、肿瘤负荷呈负相关，对评估病情、化疗效果和预后具有重要意义；血钙过高会引起高钙血症，损伤肾功能，IgG 过量会造成骨髓瘤管型阻塞肾小管，二者均可对肾脏吸收、代谢化疗药物造成严重影响，降低化疗敏感度［19］；ISS 分期和R-ISS 分期是评估MM化疗疗效和预后的重要指标，其中R-ISS分期在ISS 分期基础上基于LDH 水平和FISH 筛查分子遗传学高危分层对预后进行评估，分期越晚，疗效越差［20-21］，且肿瘤进展至后期时，癌细胞可能会学习如何修复由某类化疗药物引起的DNA 断裂，并形成使药物失活的机制，影响化疗效果［22］。本研究采用logistic 回归分析，在未调整任何因素下MM 病人血清miR-34a 水平降低化疗无效危险是正常水平病人的4.575 倍，在全因素校正后是1.933 倍，表明血清miR-34a 水平降低是MM 化疗无效的危险因素。有研究［23］发现，miR-34a 过表达可抑制M2 型巨噬细胞极化，进而减弱癌细胞的增长和迁移，增强细胞对化疗药物的敏感性。另外，miR-34a可降低MM细胞周期蛋白D1 和抗凋亡蛋白表达，阻滞细胞周期，诱发细胞凋亡，从而提高药物敏感性［24］。因此，可通过上调miR-34a 水平，抑制肿瘤细胞生长，增加MM 肿瘤细胞对化疗药的敏感性，进而提高疗效，改善预后。

综上所述，MM 病人血清miR-34a 水平降低，其中化疗无效病人血清miR-34a 水平更低，是MM 病人化疗无效的危险因素，提示可通过上调血清miR-34a 水平来提高MM 病人化疗敏感性以帮助改善预后。