药物晶型研究中溶解度的高效测定

李宏名，胡瑞馨，郑维江，邓丽

1国药集团川抗制药有限公司，成都 611731；

2四川农业大学园艺学院，成都 611130

同一种药物的不同晶型可能存在着溶解性、堆密度、吸湿性、静电吸附等理化性质、稳定性等方面的差异，而这些差异又可能影响下游结晶工艺和制剂处方过程，甚至影响制剂终产品的有效性、安全性和稳定性[1-2]。作为药物研发领域的重要分支，晶型研究越来越受到关注，已成为药物研发中的热点。为了促进和规范药物晶型研究，美国食品药品监督管理局（FDA）、人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）、国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）等监管机构相继出台了针对晶型研究的相关技术指导原则[3-5]。

在晶型研究中，晶型盐型的筛选试验所涉及的结晶方式的确定及其所用溶剂种类的选择，结晶工艺开发试验所涉及的结晶方式的确定及其所用溶剂种类的选择，诸如这些药物晶型研究实验设计，都需要大量的溶解度数据支撑[6-7]。而经典“摇瓶法”作为溶解度测定的标准方法，虽然数据准确度高，但存在检测效率低、耗时长等缺点，已不能满足晶型研究对溶解度数据量需求大的要求。如何快速、高效地获得大量的药物溶解度数据已成为晶型研究的一个棘手问题。同时，晶型研究对溶解度数据的准确性要求不高，可以允许一定程度的误差，为溶解度的高效测定创造了条件。本文旨在探讨晶型研究中溶解度的高效测定，并提供一些建设性的建议。

1 仪器设备

JXH-200 恒温振荡仪[拓赫机电科技（上海）有限公司]；JJ223BC 电子分析天平（常熟市双杰测试仪器厂）；MS-10 迷你掌上离心机（常州恩谊仪器有限公司）；1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）。

2 溶解度测定方法

2.1 常用测定方法简介 药物晶型研究中溶解度的测定，常用方法有两种。第一种方法是动态溶剂法，其原理是在一定量的固体药物中逐次加入溶剂，分别记录固体药物最后一次未溶解和第一次溶解时的溶剂量，即可计算出固体药物的溶解度范围。在实际操作中，通常先精密称取一定量的固体药物，再分3～5 次添加溶剂，如果观察到相邻两次加入溶剂时固体药物分别处于浑浊和澄清状态，则可计算出固体药物的溶解度范围；如果最后一次加入溶剂后固体药物仍然处于浑浊状态，则可计算出固体药物的最大溶解度。这种测定方法的优点是操作简单，对设备要求低，有1 台万分之一天平即可，无需额外的检测设备。这种方法也有其缺点，其一是操作繁琐，需要不停地观察体系的状态和不断添加溶剂，且每次加入溶剂后均需要混合足够的时间以确保体系达到动态平衡，溶解度测定时间长；其二是固体药物刚溶解后，还需要额外加入过量固体，并平衡一定时间后，才能确定该溶剂中的固相组成；其三是溶解度数据不够精确，只能得到溶解度的范围。第一种方法的简要流程见图1。

图1 动态溶剂法流程示意图

晶型研究中测定溶解度的第二种常用方法是静态平衡法，其原理是在一定量的溶剂中加入固体药物直至固体过量并达到静态平衡。在实际操作中，通常先加入少量的溶剂，再一次或分多次加入固体药物，直至固体不再消失，混合足够长的时间以确保固液平衡，用紫外检测法（UV）或高效液相色谱法（HPLC）检测液相中药物浓度，即为固体药物的溶解度。这种方法的优点是操作简便，加料次数少；可同时测定大量数据；溶解度数据较第一种方法更准确；固体信息容易通过X-射线粉末衍射法（XRPD）、拉曼光谱等检测方法获得。这种方法的缺点是UV 或HPLC 检测量大、耗时较长，且在溶解度较高的体系中需要较多的固体药物，容易造成物料的浪费。第二种方法的简要流程见图2。

图2 静态平衡法流程示意图

2.2 采用高效液相色谱对药物溶解度的高效测定方法为了更高效地测定溶解度以便更好地服务于晶型研究，本文提出一种新的溶解度测定方法，该方法结合了以上两种常用方法的优点。本文方法在溶解度测定时将溶解度范围进行初步分类，溶解度大于100 mg/ml 的体系采用第一种方法，可以克服第二种方法物料消耗大的缺点；溶解度10～100 mg/ml 的体系采用第二种方法，可以克服第一种方法溶解度不够精确的缺点。以下是具体的实验步骤，供晶型研究人员参考。

（1）实验设计：选择合适的溶剂填入表1；

表1 溶解度测试实验设计及结果统计

（2）按步骤1 设计的溶剂种类数一次性精密称取多份约10 mg 原料药，分别加入到已编号的2 ml 液相进样瓶中；

（3）用移液枪取步骤1 设计的溶剂各100 μl，分别加入已编号的液相进样瓶中，放入已恒温至20℃的恒温振荡仪中混合5～10 min，如果体系浑浊则进入下一步，如果体系澄清则将溶解度结果记录为“＞100”；

（4）用移液枪取步骤1 设计的溶剂各100 μl，分别加入仍然浑浊的液相进样瓶中，放入已恒温至20℃的恒温振荡仪中混合5～10 min，如果体系浑浊则进入下一步，如果体系澄清则将溶解度结果记录为“50～100”；

（5）用移液枪取步骤1 设计的溶剂各800 μl，分别加入仍然浑浊的液相进样瓶中，放入已恒温至20℃的恒温振荡仪中混合5～10 min，如果体系浑浊则将稀释倍数设定为10 倍，如果体系澄清则将稀释倍数设定为50 倍。体系于恒温20℃继续混合24 h，混合过程中可加入固体确保固体过量；

（6）混悬体系转入2 ml 离心管后离心，固相检测XRPD 法确认晶型，液相按步骤5 确定的稀释倍数稀释后用HPLC 法检测药物浓度；

（7）重复以上步骤测定高温时（建议40℃即可）的溶解度。

3 讨论

3.1 温度 不同药物的溶解度受温度的影响程度不同，大多数药物的溶解度受温度的影响较大，在测定溶解度时，温度是一个十分重要的参数。通常情况下，溶解度测定时需要同时考虑两种不同温度条件：较高的温度和较低的温度。考虑到设备对温度控制的难易程度，较低的温度通常选择室温，在晶型筛选中有时会选择一些低沸点溶剂，因此较高的温度可选择为40℃，如果不考虑低沸点溶剂，较高的温度也可选择超过40℃，如50℃或更高，但不应超过所有已选择溶剂沸点以下10℃。

3.2 样品 固体药物中杂质的种类和含量可能会影响其溶解度[8]。通常情况下，不同工艺制备的样品其杂质谱存在一定的差异。一般来说，多数情况下杂质会引起固体药物溶解度的增大，少数情况下杂质会引起固体药物溶解度的减小，某些杂质的存在甚至可能引起药物溶解度的巨大变化，从而导致溶解度测定数据的较大误差，因此溶解度测试时的样品最好采用已确定的工艺路线制备的样品。对于杂质谱相同的药物样品，纯度越高、杂质含量越低，其溶解度数据的准确性也越高，因此在晶型研究中用于溶解度测试的样品纯度应不低于95%。

3.3 溶剂 固体药物在不同溶剂中的溶解度往往不同，溶剂对溶解度的影响是多方面的。因此在进行溶解度测试时，需要考虑溶剂的多种因素，如溶剂的熔点、沸点、极性、介电常数、黏度、氢键以及溶剂与药物分子的相互作用等。在溶解度试验中，应在有限的试验数量内尽可能多地选择不同类型的溶剂，同时也应考虑溶剂残留对药物质量的影响，在药物晶型研究中的溶剂选择也应遵循ICH Q3C“优先选择使用三类溶剂，控制使用二类溶剂，尽量避免使用一类溶剂”的原则[9]。

在溶解度实验设计时，应尽可能多地选择不同结构类型的溶剂，建议优先选择以下几种常见的溶剂：甲醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、丙酮、丁酮、乙腈、甲苯、正庚烷、二氯甲烷、二甲亚砜（DMSO）、纯化水（通常加入10% DMSO）以及四氢呋喃或1，4-二氧六环（二选一或全选）。适当的时候可以选择混合溶剂。

3.4 容器 恒温振荡仪可以根据不同的使用情形，更换不同的模块，使用2 ml、5 ml 或10 ml 塑料离心管，但制造这类离心管的最主要材质是聚丙烯，可能会在某些溶剂中浸出而影响溶解度的测试结果[10]，再加上塑料离心管的密封性普遍较差，因此在溶解度测试时建议向玻璃厂家定制不同规格的带盖玻璃小瓶或者向恒温振荡仪厂家定制特殊模块，以便直接使用1.5 ml或2 ml 玻璃质液相进样瓶。另外，在整个测试过程中均应保持容器的密封，防止溶剂挥发。

3.5 平衡时间 在进行溶解度测试时，为保证数据的准确性，样品应混合足够时间以使体系达到固液平衡[11-12]。固体药物在溶液中达到固液平衡的时间与样品溶解速度、溶解度和测试时的温度密切相关，大多数药物的溶解度、溶解速度随温度升高时而增大。根据笔者经验，40℃时混合8h 或20℃时混合24 h，大多数药物能够达到固液平衡。

3.6 HPLC 色谱条件 采用HPLC 检测固液分离后液相的药物浓度，HPLC 方法可以采用已有的原料药含量检测方法，也可以开发更高效的HPLC 方法。在方法开发时，需要注意的是，选定的检测波长除该药物应有较大的紫外吸收，样品也应进行适当的稀释以使药物浓度尽量控制在已验证的线性限度内[13]；在固液分离时，也应尽量保持离心管或容器小瓶密封状态，以防止溶剂挥发，同时尽量控温，以防止温度变化对溶解度数据准确性的影响。

3.7 剩余固体分析 固体药物不同晶型的溶解度通常是不同的。溶解度测定试验中的剩余固体，如果已经发生了转晶现象，此时的溶解度为剩余固体晶型的溶解度，不再是待测药物晶型的溶解度[14]。因此，剩余固体采用XRPD、拉曼光谱等手段测定其晶型就显得非常有必要[15]。

3.8 溶解度范围 通常认为，溶解度范围10～100 mg/ml，特别是10～50 mg/ml 是晶型盐型筛选、结晶工艺开发最有用的溶解度区间。因为固体药物溶解度超过100 mg/ml 时，通常溶液体系黏度较大，固体很难析出；溶解度低于10 mg/ml 时，溶液中的药物浓度太低，不利于晶型的转化。因此，溶解度测定时，应重点关注此区域范围。

综上所述，由于药物晶型研究中晶型盐型筛选以及结晶工艺开发的实验设计均依赖于大量的溶解度数据，基于此，本文综合阐述了晶型研究中溶解度测定的相关因素，并对如何高效、快速地测定溶解度这一问题，提出相应的建议和试验方案，以期为该领域的研究提供一定的参考。