多态性BoLA Ⅰα1α2与恒定链结合及在真核细胞共定位

陈芳芳 于凤梅 刘翠艳 桂亚萍 李锦春 （安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

牛主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）又称牛白细胞分化抗原（bovine leukocyte antigen，BoLA），分为BoLA Ⅰ和Ⅱ类分子，它们在获得性免疫中分别递呈内源性和外源性抗原肽。这两类分子分别由α与β链经共价键组成异二聚体，即MHCⅠαβ和MHCⅡαβ，其中MHCⅠβ链又名β2m。研究表明，MHCⅠα链和MHCⅡβ链呈高度多态性，而MHCⅠβ链和MHCⅡα链则呈高度保守性［1-2］。MHCⅠα链由结构域α1、α2、α3、跨膜区和胞浆区组成，多态性主要集中在α1和α2，是结合内源性抗原肽的功能区。除了递呈抗原肽，牛BoLAⅠ类分子还具有激活CD8+T细胞，并与抗病毒感染能力有关［3-6］。

恒定链（invariant chain，Ii）是MHC Ⅱ类分子的伴侣分子，同一物种间高度保守而不同物种的Ii存在结构差异［7］。Ii不仅协助MHC Ⅱ类分子装配和成熟，形成三聚体（αβIi），还协助MHC Ⅰ类分子递呈外源性抗原肽。在内吞体，Ii从MHC Ⅱ类分子解离而被抗原肽取代，形成MHC Ⅱ/抗原肽复合物，并被转运到免疫细胞表面，启动体液免疫［8-9］。近年来研究发现，Ii参与了MHC Ⅰ类分子对抗原的交叉递呈和细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）应答，Ii的活性片段还可增强T细胞免疫应答［10-11］。进一步研究表明，Ii能结合MHC Ⅰ类分子，但在物种之间表现出一些不同，比如人和鸡的Ii在结合不同表型MHC Ⅰ类分子方面存在差异，而草鱼Ii与Ⅰ类分子结合则没有明显差异［12-14］。

总之，迄今关于Ii与MHC Ⅱ类分子的结合、迁移以及互相作用的研究较多，而Ii与MHC Ⅰ类分子的研究，诸如两者在结合特性方面，特别是在哺乳动物Ii结合MHC Ⅰ类分子功能片段方面还缺乏研究。为深入认识两类MHC分子的演化过程特点与互相作用机制，本研究在克隆牛BoLA Ⅰα链基因特点的基础上，探明Ii与MHC Ⅰα链之间结合和胞内定位特征，为进一步揭示Ii和MHC Ⅰ类分子的关系以及在免疫应答中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DNA marker和限制性内切酶等购自大连宝生物工程有限公司；T4DNA连接酶和ExTaq酶购自日本ToYoTa公司；转染试剂Xfect等购自北京Clontech生物工程有限公司；大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞购自北京天根生物有限公司；小鼠抗GST、His、GFP、RFP一抗和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG二抗均购自中北京杉金桥生物技术有限公司；质粒提取试剂盒（OMEGA公司，美国）；DNA凝胶回收试剂盒（诺唯赞生物科技股份有限公司，中国南京）；Gluttathione Sepharose 4B柱和电化学发光（electrogenerated chemiluminescence，ECL）试剂盒、谷胱甘肽琼脂糖树脂（glutathione agarose resin，GST）纯化柱和His蛋白纯化镍柱购自瑞典GE公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和DMEM培养基均购自Hyclone生物有限公司；293T细胞、pET-32a、PGEX-4T-1、pmCherry-C1、pEGFP-C1和pEGFP-N1均由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物与质粒 自行设计的引物序列、内切酶和构建的重组质粒名称如表1所示。参照NCBI蛋白质结构分析网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）对BoLA Ⅰα结构进行比对分析，以表1中设计的引物扩增，获得目的基因中相应的结构域片段，构建的重组质粒如表1所示。

表1 本研究中使用的引物序列和重组质粒Tab.1 Primer sequences and recombinant plasmids were used in this study

1.2.2 基因的扩增和比对分析 参照GenBank登记的BoLAⅠα基因序列（ID：L02835），自行设计一对引物，并从3头淮北黄牛采集血样，分别提取mRNA，然后以反转录获得的cDNA作为模板进行目的基因扩增。经过初步鉴定的阳性质粒进一步做DNA测序（南京擎科）。对所获基因序列应用生物学软件DNAstar和MEGA4.0进行比对分析，应用Wu-Kabat方法进行多态性分析［15-16］。

用表1的引物从cDNA分别克隆基因片段BoLAⅠα1α2α3、BoLA Ⅰα1α2、BoLA Ⅰα3和Ii（如表1）。基因的扩增、重组质粒的构建和鉴定参照本课题组已经建立的方法［17］。

1.2.3 重组菌的构建、表达和鉴定 经鉴定正确的重组质粒pET-32a-BoLA Ⅰα1α2α3、pET-32a-BoLAⅠα1α2、pET-32a-BoLA Ⅰα3和pGEX-4T-1-Ii分别转染感受态细菌Rosetta（DE3），构建4个分别含上述质粒的重组菌。重组菌再次经PCR和测序鉴定后，用0.4 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）于16 ℃进行诱导表达20 h。收集的菌体用180周，5 s，间隔10 s超声波破碎菌体，经12 000 g离心15 min收集菌体沉淀，SDSPAGE电泳进行鉴定蛋白表达。包涵体蛋白复性处理参考张浩等的方法［18］。

1.2.4 亲和层析纯化目的蛋白 重组菌分别表达目的蛋白His/BoLAⅠα1α2α3、His/BoLAⅠα1α2、His/BoLAⅠα3和GST/Ii。其中，含His标签的蛋白用镍柱纯化，含GST标签的蛋白用GST亲和层析柱（Glutathione sepharose 4B）纯化。纯化产物用SDSPAGE进行检测。

1.2.5 拉下法、免疫印迹检测和验证目的蛋白间的相互作用 将GST/Ii加入GST亲和层析柱内作为锚定蛋白，4 ℃冰箱内平衡30 min，然后将His/BoLAⅠα1α2α3、His/BoLAⅠα1α2、His/BoLAⅠα3以及His（对照）分别加入柱内，孵育1 h后用5倍柱体积的PBS洗脱，再经10 mmol/L谷胱甘肽解离液洗脱，收集洗脱液，分别进行SDS-PAGE凝胶电泳观察电泳条带，并应用转移电泳和免疫印迹法检测与Ii结合的关联蛋白，具体操作同牛夏忆等［19］的方法。

1.2.6 细胞培养、真核转染和共聚焦观察关联蛋白的共定位 293T细胞的培养、重组质粒的转染参考本课题组前期建立的方法［17］。将pEGFP-N1-Bo-LA Ⅰα1α2α3、pEGFP-N1-BoLA Ⅰα1α2、pEG-FPN1-BoLA Ⅰα3分别与pmCherry-C1-Ii共转染293T细胞，培养24 h后在激光共聚焦显微镜下观察两种分子在细胞的共定位。

2 结果

2.1 目的基因的克隆、鉴定与结构分析 首先，从3头淮北黄牛获得75条BoLA Ⅰa基因序列，经比对分析分为5个基因型，序列上传GenBank，获登录序号分别为KF831068、KF831069、KF831070、KF831071和KF831072。分析其结构如图1，分别由α1、α2、α3、T（跨膜区）和C（胞浆区）组成。进一步对获得的序列进行多态性分析，结果发现牛至少存在5种以上BoLAⅠα基因型，不同结构域都表现出多态性，尤其是BoLAⅠα链的抗原肽结合区域（α1α2）和胞浆区（图2）。其次，用自行设计的引物（表1）分别克隆所需基因片段BoLAⅠα1α2α3、BoLAⅠα1α2、BoLAⅠα3和Ii，在琼脂糖电泳中获得与预期大小一致的条带，分别为864 bp、579 bp、306 bp和612 bp（图3，泳道1c，2c，3c和4c）。

图1 构建的BoLA Ⅰα片段结构示意图Fig.1 Schematic diagram of structured BoLA Ⅰα fragments

图2 BoLA Ⅰα链5个结构域的氨基酸变异性Fig.2 Amino acid variability of five domains of BoLA Ⅰα chain

图3 基因扩增和重组质粒双酶切鉴定Fig.3 Amplification of genes and identification of recombinant plasmids by restriction endonuclease digestion

2.2 重组质粒构建及其表达鉴定 构建4个原核表达重组质粒pET-32a-BoLA Ⅰα1α2α3、pET-32a-BoLA Ⅰα1α2、pET-32a-BoLA Ⅰα3和pGEX-4T-1-Ii（图3，泳道a），应用双酶切进行鉴定，获得预期大小的片段（图3，泳道b），经测序表明符合预期DNA序列。进一步将原核表达重组质粒分别转染工程菌Rosetta（DE3），经诱导表达、纯化和复性的目的蛋白，如图4所示，在SDS-PAGE中呈现预期大小的蛋白条带，His/BoLA Ⅰα1α2α3、His/BoLA Ⅰα1α2、His/BoLA Ⅰα3和GST/Ii分别为51.7 kD、41.2 kD、31.2 kD和48.4 kD（其中His大小约为22 kD，GST大小约为26 kD）（图4）。这表明，目的蛋白能够在原核细胞中被表达。

图4 目的蛋白表达和纯化的鉴定Fig.4 Identification of products expression and purification

2.3 原核表达的BoLA Iα与Ii分子的结合域 为明确原核表达的BoLA Ⅰα的结构域α1α2α3、α1α2、α3与Ii的互相作用特征，采用拉下法进行检测。在GST亲和层析柱中，原核表达和纯化的GST/Ii以及对照GST分别作为锚定蛋白被滞留，随后分别加入His/BoLA Ⅰα1α2α3、His/BoLA Ⅰα1α2或His/BoLAⅠα3与之作用，如它们与Ii分子结合，则形成复合物而不被PBS洗脱，随后加入谷胱甘肽解离液洗脱时这些复合物被一起从柱上解离，可在SDS-PAGE电泳中出现相应两个条带；如它们不与Ii结合，则被PBS洗脱，在SDS-PAGE中只出现GST/Ii或者GST一条带。图5A、B的结果显示，在泳道2呈现两条蛋白条带，其大小分别与GST/Ii和His/BoLA Ⅰα1α2α3（图5A，泳道1和泳道3）、His/BoLA Ⅰα1α2（图5B，泳道3）相同，表明它们结合并形成的聚合物在SDS作用下被解离；但是，由于His/BoLA Ⅰα3不能被GST/Ii结合，在层析柱中被PBS洗脱，故在图5C的泳道2内只出现GST/Ii一条带。上述结果表明，Bo-LA Ⅰα的α1α2是结合Ii的结构域。

图5 拉下法鉴定His/BoLA Ⅰα片段结合GST/IiFig.5 Identification of binding of His/BoLA Ⅰα fragment to GST/Ii by pull down

2.4 免疫印迹验证Ii与BoLA Ⅰα1α2的结合产物 为进一步确定在拉下法中结合的Ii和His/Bo-LA Ⅰα1α2，采用免疫印迹法对其检测验证。将SDS-PAGE产物经电泳转移至纤维膜上，应用特异性抗体检测。结果如图6所示，含有His标签的分子均能被特异性抗体识别。在拉下法中与GST/Ii结合的聚合物GST/Ii+His/BoLA Ⅰα1α2α3或GST/Ii+His/BoLA Ⅰα1α2经SDS解离成GST/Ii和His/BoLA Ⅰα 1α2α3或His/BoLA Ⅰα1α2（图6，泳道1，2），但由于GST/Ii不能结合His/BoLA Ⅰα3，所以在拉下法中未被滞留而在解离前被洗脱，在图6泳道3中就没有相应条带。对照组［未经拉下法处理的His/BoLA Ⅰα1α2α3、His/BoLA Ⅰα1α2或His/BoLA Ⅰα3（图6泳道4，5，6）］也能被特异性抗体所识别。上述结果表明在拉下法中Ii结合的是His/BoLA Ⅰα1α2。

图6 免疫印迹鉴定被Ii结合的BoLA Ⅰα片段Fig.6 Identification of BoLA Ⅰα fragments bound to Ii by Western blot

2.5 BoLA Iα结构域在细胞内与Ii的共定位 Bo-LA Ⅰ类分子结合Ii以及递呈抗原肽是在特定细胞器内进行的，α1α2能否与Ii一起进入相同的细胞器是确定这两种分子具有互相作用的关键。为此，本研究进一步检测了它们在真核细胞内的共定位。将构建的含绿色荧光蛋白GFP/BoLA Ⅰα1α2α3、GFP/BoLA Ⅰα1α2和GFP/BoLA Ⅰα3的重组真核质粒分别与红色荧光蛋白RFP/Ii重组真核质粒共转染293T细胞，培养后采用激光共聚焦显微镜观察两类关联蛋白分子在细胞内的定位。由于GFP和RFP分别为绿色和红色荧光，当两种蛋白在细胞器中共定位时，两种颜色的荧光蛋白叠加后则呈现橙黄色。如图7A、B所示，在共转染的细胞中，GFP/Bo-LA Ⅰα1α2α3和GFP/BoLA Ⅰα1α2呈绿色，而GFP/Ii呈红色，在叠加图中，部分呈橙黄色（如箭头所示），表明α1α2与α1α2α3相同，能与Ii在细胞内共定位。在对照组中，GFP/BoLA Ⅰα3与单一GFP在细胞内定位相似呈绿色，但在重叠图中，并不呈黄色。这表明α3不与Ii在细胞内共定位。上述结果表明，BoLA Ⅰα1α2能够与Ii共定位，而BoLA Ⅰα3则不能。

图7 BoLA Ⅰα1α2与Ii在真核细胞的共定位Fig.7 Co-localization of BoLA Ⅰα1α2 with Ii in eukaryotic cells

3 讨论

BoLA Ⅰα链的结构域α1α2既是抗原肽结合区，也是与Ii结合的功能区。脊椎动物的MHC Ⅰα链的α1α2位于抗原肽结合区，呈高度多态性，在递呈内源性抗原中起关键作用，而α3是免疫球蛋白样区，具有保守性。鸡MHC Ⅰα链通过结构域α1α2结合Ii［20］。为了解牛BoLA Ⅰα1α2结构域是否结合Ii，以及α3在其中的作用，本研究分别构建了α1α2和α3片段，观察两者结合Ii的特性。结果表明，Bo-LA Ⅰα链与其他脊椎动物相似，其α1α2也是结合Ii的功能结构域，而单一的α3结构域具有结合Ii的功能；同时在α1α2α3中，α3并不影响α1α2与Ii的结合。本研究结果也证实，原核表达的α1α2与Ii复性后保持了自然结构，不仅能稳定地互相结合，还能在免疫印迹中被特异性抗体识别。特别是这两个真核表达的蛋白分子还能在胞内共定位，表明α1α2不仅维持了必要的结构，还具有进入细胞器并结合Ii的重要功能，而α3不能与Ii结合，也不能进入相应细胞器与Ii共定位，这提示α3结合Ii与BoLA Ⅰα链在细胞器内定位无关，但是其是否具有其他作用，尚需进一步研究。

BoLA Ⅰα链的α1α2多态性及结合Ii特征进一步验证了MHC Ⅰ与Ⅱ类分子的同源性。基于MHCⅠ类和Ⅱ类分子所处染色体位置、分子结构和功能特征，被认为它们具有同源关系［21］。近年来关于这两类MHC分子与Ii关系有一些重要发现，如Ii与MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子基因的多态性特点及其在免疫器官中的表达呈高度相关性，而本研究结果则进一步丰富了这一理论［13，22］。首先，BoLA Ⅰα的α1α2结构域具有多态性特征，α1α2位于BoLA Ⅰ类分子的肽结合区且其多态性最高，这与其他哺乳动物相似。其次，Ii是MHC Ⅱ类分子的伴侣蛋白，在协助递呈抗原肽中，Ii内质网浆区的CLIP（class-Ⅱ-associated invariant chain peptide）占据MHC Ⅱ类分子的抗原肽结合区，与之形成三聚体。MHC Ⅱ类分子β链的β1是肽结合区，也是与Ii结合的功能区［23-24］。尽管多种动物的Ii也能稳定结合MHC Ⅰ类分子，如鸡MHC Ⅰ类分子α链的肽结合区α1α2结合，但尚无哺乳动物的数据［12-14，24］。本研究明确了牛Ii所结合的也是BoLA Ⅰ类分子的肽结合区α1α2。这就证明脊椎动物Ii所结合的两类MHC分子均是其肽结合区（MHC Ⅰ类分子的α1α2和MHC Ⅱ类分子的β1），它们在结构方面高度相似。再次，研究表明Ⅰ类分子递呈内源性抗原肽启动CD8+T细胞免疫，而近年来发现Ii通过交叉递呈也参与了细胞免疫［10］。Ii通过结合MHC Ⅱ类分子的肽结合区参与递呈外源性抗原肽，而本研究发现Ii既能结合BoLA Ⅰ类分子肽结合区，也能与之在真核细胞内共定位，提示两者在递呈抗原肽方面具有相似的途径和功能。

本研究采用原核表达系统，不仅能大量表达目的蛋白，而且经过复性，目的蛋白分子α1α2和Ii均恢复了其稳定的天然结构，具有互相结合的功能和被特异性抗体识别的特性［21-26］。这为今后的研究提供了可靠的技术支撑。