2个候选lncRNA的克隆、序列分析及其在奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中的表达

董益闻,罗仍卓么,王兴平,王晋鹏,周 力

(1. 宁夏大学动物科技学院,银川 750021;2. 宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室,银川 750021)

【研究意义】长链非编码RNA(Long intergenic non-coding RNA,LncRNA)是一类编码蛋白质能力有限的转录本,其长度大于200 nt[1]。据报道,lncRNA通过不同方式发挥各种生物学作用,如lncRNA不仅能够作为ceRNA与miRNA竞争性结合来调控miRNA及其靶基因转录;同时还可直接与mRNA结合导致mRNA降解;此外,lncRNA作为分子支架将表观修饰的酶或染色质修饰因子联合在一起,从而调节基因的表达。【前人研究进展】LncRNA在多种疾病中扮演着重要的调控角色,如lncRNA HOXA-AS2在肝癌[2]、胃癌[3]和大肠癌[4]等癌症中发挥着调控作用,Kong等[5]研究发现,lncRNA-CDC6海绵吸附miR-215能够促进乳腺癌。LncRNA FAH2-2与MLKI相互作用调控动脉粥样硬化引发的炎症反应[6]。在奶牛乳腺炎中,Ma等[7]研究证实,lncRNA XIST通过NF-κB/NLRP3途径参与奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应。目前虽然对奶牛乳腺炎进行了一些lncRNA的相关研究,但仍有大量差异表达的lncRNA未被发掘。【本研究切入点】在前期研究中发现了lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349在奶牛乳腺炎中差异表达。lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的序列及其在乳腺上皮细胞炎症中的表达情况尚未报道。【拟解决的关键问题】本研究拟以新发现的lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349为候选基因,进行lncRNA的克隆、生物信息学分析及其在LPS诱导不同时间的奶牛乳腺上皮细胞炎症中的表达检测,为深入研究奶牛乳房炎的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

本研究以宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室冻存的、经细胞免疫荧光实验鉴定的MAC-T奶牛乳腺上皮细胞[8-9]作为试验材料。

1.2 主要试剂

LPS由Sigma-Aldrich公司(美国)提供;DMEM/F12培养基、胰蛋白酶和PBS缓冲液由Hyclone公司(美国)提供;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)由BI公司(以色列)提供;TRIzol试剂和PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒由宝日医生物技术(北京)有限公司提供;pMD19 T-Vector与DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司提供;DNA回收纯化试剂盒由Omega公司(美国)提供;2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(withTli RNaseH)荧光定量试剂盒由北京聚合美生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 MAC-T细胞的培养 在37 ℃水浴锅中解冻冻存在液氮中的MAC-T细胞,接种至6孔细胞培养板,在DMEM/F12培养基(含10% FBS)、37 ℃、100%饱和湿度和5% CO2细胞培养箱中进行贴壁培养。当细胞生长融合度至80%～90%时,采用0.25%的胰酶消化贴壁的细胞,进行传代培养,备用。

1.3.2 候选lncRNAs的克隆及测序 用TRIzol试剂盒并严格按照其说明书提取MAC-T细胞的总RNA,采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为第一链cDNA。应用Primer Permier 5.0软件设计lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的扩增引物(表1)。以上述第一链cDNA为模板,进行上述2个lncRNA的第二链扩增。反应体系为：上、下游引物各1 μL,模版cDNA 3 μL,2×TaqMaster Mix (Dyc Plus) 10 μL,加RNase-free H2O至20 μL。反应条件为：预变性95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s, 56 ℃(lncRNA TCONS-72171)/58 ℃(lncRNA TCONS-6234 9)30 s,72 ℃ 1 min(39个循环),72 ℃终延伸5 min。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行lncRNAs扩增产物片段大小检测。

扩增产物经纯化回收后,与T载体进行连接,并通过转化、阳性克隆筛选及菌液PCR实验后,挑取阳性克隆菌液,送往杨凌奥科生物技术有限公司进行测序。

1.3.3 候选lncRNAs序列分析 为全面了解候选lncRNAs的序列特征,将测序所得序列输入NCBI数据库中的BLAST在线工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析候选lncRNAs位于的染色体。利用DNAMAN软件对候选lncRNAs进行同源性比对。应用lncLocator在线工具(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)预测候选lncRNAs的亚细胞定位。

1.3.4 奶牛乳腺上皮细胞炎症模型构建 体外培养奶牛乳腺上皮细胞,待细胞生长至60%～70%融合度时,用终浓度50 ng/μL的LPS诱导细胞,建立炎症模型。分别在LPS诱导的第0、3、6和12小时收集细胞,利用RT-qPCR技术验证细胞炎症模型的可靠性。

表1 候选lncRNAs克隆的PCR引物

1.3.5 奶牛乳腺上皮细胞总RNA提取、RT-qPCR检测 利用TRIzol法提取上述处理细胞的总RNA,并利用微量紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度和浓度。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。采用RT-qPCR技术检测候选lncRNAs和IL-1β和IL-6基因mRNA水平的表达量。反应体系为：上、下游引物(表2)各1 μL,cDNA模板2 μL,2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(withTli RNaseH)10 μL,加RNase-free H2O至20 μL。反应条件为：初始变性95 ℃ 30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,共40次循环;然后95 ℃ 10 s,65 ℃降温5 s。

1.3.6 候选lncRNAs的靶基因预测及KEGG功能注释分析 本研究从顺式作用和反式作用两方面预测候选lncRNAs的靶基因。采用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)进行功能注释(P<0.05),分析候选lncRNA的生物学功能。

2 结果与分析

2.1 候选lncRNAs真实性鉴定

为验证候选lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的真实性,本研究进行候选lncRNAs的PCR克隆,并将产物回收后送往公司测序。测序结果显示,本研究获得340 bp的lncRNA TCONS-72171(图1)和552 bp的lncRNA TCONS-62349的序列(图2)。由此确定,候选lncRNAs真实存在。

2.2 候选lncRNAs的序列分析

通过NCBI数据库中的BLAST在线工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析结果表明lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349分别位于20号和19号染色体上。利用DNAMAN软件分析物种保守性,根据比对结果发现本研究获得的牛lncRNA TCONS-72171和羊(XM_027979975)、鹿(XM_020875053)之间的同源性分别为97.03%和94.41%,说明该lncRNA在这3个物种间是高度保守的;此外,本研究还发现牛lncRNA TCONS-62349和羊(XR_003590712)之间的同源性为95.31%。LncLocator在线工具(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)的预测结果显示,lncRNA TCONS-72171大部分存在于细胞质中,而lncRNA TCONS-62349大部分位于细胞核中(表3)。综上推测,lncRNA TCONS-72171可能在转录后水平反式调控相关基因的表达,例如调节mRNA翻译和降解等,或参与细胞内信号通路的调控;lncRNA TCONS-62349可能与DNA、RNA或蛋白质等多种分子相互作用,调控染色体的结构和功能。

表2 RT-qPCR引物

图1 lncRNA TCONS-72171的PCR扩增和测序Fig.1 PCR amplification and sequencing of lncRNA TCONS-72171

图2 lncRNA TCONS-62349的PCR扩增和测序Fig.2 PCR amplification and sequencing of lncRNA TCONS-62349

表3 候选lncRNAs的亚细胞定位预测

** 表示 P<0.01,下同。** indicates P<0.01. The same as below.图3 IL-6和IL-1β基因在LPS诱导炎症的奶牛乳腺上皮细胞中的表达Fig.3 Expression of IL-6 and IL-1β gene in bovine mammary epithelial cell with LPS-induced inflammation

2.3 奶牛乳腺上皮细胞炎症模型构建

采用LPS诱导体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,构建细胞炎症模型。RT-qPCR结果显示,与0 h相比,在LPS诱导3、6和12 h奶牛乳腺上皮细胞中的IL-6、IL-1β基因表达极显著上调(P<0.01),说明本研究成功构建LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症模型(图3)。

2.4 候选lncRNAs在奶牛乳腺上皮细胞炎症中的表达模式

为验证候选lncRNAs在LPS诱导的奶牛乳腺上皮炎症不同时间的表达情况,采用RT-qPCR检测候选lncRNAs的表达。结果(图4)表明,与0 h相比,lncRNA TCONS-72171与lncRNA TCONS-62349在LPS诱导3、6、12 h的奶牛乳腺上皮细胞中的表达量均极显著上调(P<0.01)。

2.5 候选lncRNAs的靶基因预测和KEGG功能注释分析

通过对候选lncRNAs的顺式和反式靶基因进行预测。结果显示,lncRNA TCONS-72171的顺式靶基因为LCP2,反式靶基因为SNTG1、ENSBTAG00000052085、FAM221A、ENSBTAG00000033806、ENSBTAG00000005140和LGR6(图5-A)。lncRNA TCONS-62349的顺式靶基因为ALOX15、SLC16A13、SLC16A11、ASGR1、BCL6B、ASGR2、ENSBTAG00000053786、ARRB2、PELP1、C19H17orf49、ALOX12、RNASEK、CLEC10A和ALOX12E(图5-B),并未发现lncRNA TCONS-62349可能的反式靶基因。

由此,对上述候选靶基因进行KEGG功能注释分析,进一步推测候选lncRNAs是否参与炎症反应。结果表明,lncRNA TCONS-72171可能参与调控FcεRI、TGF-β、T细胞受体、Wnt等与炎症性疾病发生发展相关的信号通路(图6-A)。lncRNA TCONS-62349可能参与5-羟色胺能突触、TRP通道调控炎性介质等与炎症发生发展相关的信号通路(图6-B)。上述结果表明,2个候选的lncRNA可能与奶牛的乳腺上皮细胞炎症反应的调节有关,有待于进一步验证。

图4 候选lncRNAs在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中的表达Fig.4 Expression of candidate lncRNAs in LPS-induced bovine mammary epithelial cell inflammation

图5 lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349的靶基因预测Fig.5 Target gene prediction of lncRNA TCONS-72171 and lncRNA TCONS-62349

A：lncRNA TCONS-72171的分析结果; B：lncRNA TCONS-62349的分析结果。A： Analysis results of lncRNA TCONS-72171; B： Analysis results of lncRNA TCONS-62349.图6 lncRNA TCONS-72171与lncRNA TCONS-62349的KEGG功能注释Fig.6 KEGG functional annotation of lncRNA TCONS-72171 and lncRNA TCONS-62349

3 讨 论

奶牛乳腺炎是乳腺组织受外界因素刺激产生的炎症性疾病,以高发病率、繁殖率降低等特点影响奶制品的品质与产量,是制衡奶业发展的关键原因之一[10]。大肠杆菌(Escherichiacoli)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引发奶牛乳房炎最常见的病原菌,而LPS作为E.coli细胞壁的主要成分,在E.coli侵袭乳腺组织后会刺激IL-6、IL-1β等炎症因子的分泌增多,往往导致机体产生炎症反应,因此研究中常用LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞建立炎症模型[11]。

lncRNA在细胞周期及细胞分化、增殖和凋亡等多个生物学过程中发挥着重要功能[12]。近年来,相关研究发现lncRNA在免疫相关疾病中也发挥着重要的调控作用,如lncRNA SNHG16通过海绵吸附miR-520,进而调控VEGF在肺癌中发挥作用[13]。lncRNA Xist激活miR-335/SOD2/ROS信号通路抑制非小细胞肺癌的发展[14]。在炎症性疾病中,lncRNA MEG3在TNF-α处理的角质形成细胞和银屑病小鼠中抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路增强细胞自噬和抑制炎症[15]。lncRNA在奶牛乳腺炎中同样扮演着重要角色,如LRRC75A-AS1参与调控NF-κB信号通路和调节TJ蛋白在MAC-T细胞炎症中发挥作用[16]。但并未发现有关候选lncRNAs(lncRNA TCONS-72171、lncRNA TCONS-62349)的研究,因此本研究对候选lncRNAs进行了真实性检验,对其中间片段进行PCR克隆并进行测序,确认真实存在后分别进行同源性比对发现,候选lncRNAs在不同物种间高度保守,这预示可以根据其他物种上的相关研究进行功能推测。

为探索候选lncRNAs与奶牛乳腺上皮细胞炎症的关系,以LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞为炎症模型,发现候选lncRNAs的表达量在LPS诱导后的不同时间表达量均极显著上调,表明候选lncRNAs在奶牛乳腺上皮细胞炎症中扮演着重要角色。此外,通过对候选lncRNAs进行靶基因预测及KEGG功能注释,结果发现lncRNA TCONS-72171的靶基因LCP2[17]和LGR6[18]都与炎症性疾病有关。其中,LCP2[19]同时也是JAK-STAT信号通路中STAT1的靶基因。JAK-STAT信号通路的核心有3个部分,分别是细胞因子受体、JAKs(包含JAK1、JAK2、JAK3和TYK2共4个成员)和STATs(包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6共7个成员)[20]。JAK-STAT信号通路与炎症性疾病关系十分密切,如IL-6受体和IFN受体可以通过JAK-STAT信号通路分别响应IL-6家族(IL-6、IL-11和LIF等)和IFN-γ的细胞因子[21-22]。由上述研究结论可知,lncRNA TCONS-72171可能通过调控靶基因LCP2来影响STAT1表达,进而通过JAK-STAT信号通路调节奶牛乳腺上皮细胞炎症。

在本研究中,lncRNA TCONS-62349的靶基因预测结果表明,与炎症性疾病有关的靶基因有ALOX15[23]、ASGR1[24]、BCL6B[25]、ARRB2[26]、PELP1[27]、ALOX12[28]、CLEC10A[29]和ALOX12E[30]。从上述文献可知,ALOX15、ASGR1、ARRB2、PELP1和ALOX12都与NF-κB信号通路有着密切联系。NF-κB家族包含5种转录因子：p50、p52、p65(RelA)、c-Rel和RelB,除RelB只能与p50和p52形成异源二聚体以外,其他家族成员可通过Rel同源结构域组合成为同源或异源的NF-κB二聚体,从而调节下游基因的转录[31]。在炎症性肠病中,lncRNA NEAT1的表达上调,通过促进NF-κB/p65的转运激活NF-κB信号通路,促进炎症发展[32];在Nd2O3处理后的小鼠肺组织中,上调的lncRNA H19通过激活NF-κB,促进TNF-α、IL-6等炎症因子的表达进而加剧肺组织炎症和肺纤维化[33]。由此推测,lncRNA TCONS-62349可以通过ALOX15、ASGR1、ARRB2、PELP1和ALOX12这些靶基因介导NF-κB信号通路的激活,从而对奶牛乳腺上皮细胞炎症具有调控作用。

KEGG功能注释分析显示,lncRNA TCONS-72171富集到的信号通路中,FcεRI[34]、TGF-β[35]、T细胞受体[36]、Wnt[37]信号通路在炎症性疾病中发挥着调控作用;lncRNA TCONS-62349参与到5-羟色胺能突触[38]、TRP通道调控炎性介质[39]、Relaxin[40]、坏死性细胞凋亡[41]、趋化因子[42]和MAPK[43]等与炎症发生发展相关的信号通路。由此可以进一步推测,候选lncRNAs可能通过潜在靶基因而调控上述炎症相关信号通路,进而调节奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应。

4 结 论

奶牛lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349真实存在,且在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中的表达均极显著上调。此外,极显著上调的lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349可能通过其潜在靶基因参与JAK-STAT、NF-κB和MAPK等炎症相关的信号通路,在奶牛乳腺上皮细胞炎症发挥调控作用。