生物菌剂与土壤熏蒸互作对三七土壤微生物群落结构的影响

刘博文,李 蓉,杨 萍,李明鉴,王艳林,魏富刚,黄 永

(1.成都中医药大学药学院,成都 611137;2.文山苗乡三七科技有限公司,云南 文山 663099)

【研究意义】三七连作障碍严重影响其药效质量和产量[1]。土壤熏蒸是目前缓解连作障碍的最主要途径[2]。然而土壤熏蒸无差别杀灭土壤中的微生物,导致土壤物种多样性降低[3]。且熏蒸不能降低三七化感自毒物质,同时导致部分农药残留量增加[4]。根腐病高发是三七连作障碍的主要表现形式[5],目前防治三七根腐病的主要措施是化学农药的施用,农药残留对人体健康存在潜在的安全隐患[6]。近年来的研究证实,熏蒸后及时补充生物菌快速占领空白生态位,有助于形成抑病土壤,增强土壤对土传疾病的抑制作用[7]。【前人研究进展】病原菌的生物量会随着三七种植年限的增加积累,同时土壤从“细菌型”向“真菌型”转变,从而导致根腐病高发继而引发连作障碍[8]。常见的轮作管理模式需要5～7年才能基本消除三七连作对土壤造成的负面影响,不能满足三七产业可持续发展需求[9]。棉隆熏蒸能有效消除连作土壤的负面效应,防治土传病害发生[10],对多种疫霉属(Phytophthora)和镰刀属(Fusarium)病原菌有较高的抑制作用,但其减退作用无法达到100%[2]。熏蒸后土壤环境“真空”且益生菌属受到抑制[3],繁殖能力强的病原菌可快速恢复至原水平。木霉菌(Trichoderma)对棉隆有极其优良的耐受性,熏蒸可以创造出增强木霉菌有机质分解能力的土壤环境,早期投入能迅速繁殖占领空白生态位[11],从而充分发挥其生防潜能。芽孢杆菌(Bacillus)应用于多种植物镰刀属病原菌所致根腐病时都表现出较好的防效[12];刘海娇等[13]从三七连作土壤中分离得到的假单胞菌(Pseudomonas)对丛赤壳科(Nectriaceae)根腐病致病菌有较强的抑制作用;叶云峰等[14]证实木霉菌对三七根腐病病原菌人参链格孢(Alternariapanax)和尖孢镰刀菌(Fuariumsolani)有良好的抑制效率。此外,木霉菌与芽孢杆菌、假单胞菌等生物细菌组合施用具有提高生物效果的潜能[15]。土壤微生物直接或间接作用于营养元素的转化和循环过程,是土壤质量演替的关键因素[16]。三七种植过程中,土壤有效氮和速效磷的累积以及速效钾的耗竭导致营养不均衡是产生连作障碍的原因之一[17]。因此,明确生物菌剂对熏蒸后三七土壤微生物群落结构和土壤环境的影响,对于优化三七种植过程中的管理模式具有指导价值。【本研究切入点】熏蒸剂在缓解三七连作障碍方面的应用已较成熟,但生防菌作用于三七根腐病病原的研究多停留在体外实验阶段,特别是熏蒸后复配多种生物菌剂对三七连作土微生态的研究仍是空白。本研究设置熏蒸、熏蒸配施生物菌剂、非熏蒸、非熏蒸配施生物菌剂4个试验组,分析不同组土壤主要理化性质和微生物群落组成差异。【拟解决的关键问题】考察熏蒸后添加益生菌剂是否对三七微生态的改善有促进作用,揭示熏蒸和生物菌剂对三七根际微生物群落构建的影响,为优化三七种植管理方法提供合理依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试植物为生长近半年的三七种苗(籽条),生防菌剂为枯芽春®(Bacillussubtilis,1×108CFU/g)、木每灵®(Trichodermaharzianum,1×108CFU/g)和荧光棒®(Pseudomonasfluorescens,5×108CFU/g),试验地选址在云南省文山市丘北县树皮乡小新寨苗乡三七有限公司三七种植基地(23°49′46.99′′ N, 104°06′12.99′′ E)。土壤前茬作物为菊花和烤烟,轮作时间为3年,轮作前经历3年完整三七种植周期,试验采取完全随机区组设计,土壤条件分为熏蒸地(LZ地)与非熏蒸地(PX地),处理方式分为常规管理模式(CG处理)与生物农药处理模式(TK处理)。LZ地使用450 kg/hm2棉隆覆膜熏蒸30 d,揭膜7 d后进行移栽,PX地不作熏蒸;处理方式见表1。按照起垄方式种植三七,每垄3.36 m2,栽种120株三七种苗,每60垄设为1个小区作为重复,每组设置3个重复。三七籽条于2021年7月进行移栽,2022年1月采集80株以上三七样品,统计农艺性状数据。试验期间不定期巡查田间,及时清除有根腐病症状的幼苗,实验结束时每组随机选取6垄地统计存活数作为评价组间防效差异的依据。

表1 田间试验设计

1.2 根际土壤样品的采集

在每个小区采用五点取样法,采取三七带土根系,抖落非根际土,将根系样品转移至含20 mL无菌10 mmol/L PBS溶液的50 mL无菌离心管后,置于摇床震荡20 min(120 r/min,4 ℃),使用无菌镊子挑除离心管中的根系,剩余悬浮液离心30 min(6000 r/min,4 ℃)后去除悬浮液,收集得到2 g左右的根际土壤,置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3 土壤理化性质

在每个小区内采用五点取样法,取得根周5～15 cm深的表层土壤作为理化分析样本。pH仪测定土壤pH;碱解扩散法测定土壤碱解氮;火焰光度法测定土壤速效钾;碳酸氢钠提取法测定土壤速效磷。

1.4 土壤DNA提取、PCR扩增及测序

按照DNA提取试剂盒MN NucleSpin 96 Soi得到终浓度为4～5 ng/μL的根际土壤DNA。引物合成、扩增步骤由百迈克公司完成。以引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′) 和806R2( 5′-GGA CTACNVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌16S rRNA V4区域;以引物ITS1(F5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)扩增真菌ITS1区域。PCR条件：95 ℃预变性5 min,98 ℃10 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s循环10次,72 ℃退火5 min。后续测序使用Illumina Novaseq(Illumina, San Deigo,CA)平台进行。

1.5 数据处理

使用Trimmomatic v0.33[18]对原始数据进行质量过滤,使用Usearch v10[19]进行双端序列凭借,使用UCHIME v4.2[20]去除嵌合体得到有效数据。使用Usearch v10在相似性97%水平上对序列进行聚类,以所有序列数的0.005%作为过滤OTUs的阈值。以SILVA[21]为参考数据使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释。利用R语言工具[22]进行α多样性计算、PCoA分析、RDA分析。使用STAMP[23]软件分析组间物种显著性差异。属水平热图距离算法为eculidean,聚类算法为complete。PCoA分析距离算法为bray_curtis。

2 结果与分析

2.1 三七根际土壤物种组成分析

2.1.1 物种数量分析 16S rRNA测序共获得1200 897对序列,质控、拼接后产生1198 632条有效序列,每个样品至少产生79 555条有效序列,共产生1794个OTUs。其中LZCG组有1541个OTUs,LZTK组有1470个OTUs,PXCG组有1685个OTUs,PXTK组有1663个OTUs。PXTK-PXCG共有OTU 1588个,LZTK-LZCG共有OTU 1402个。PXTK-LZTK共有OTU 1343个,PXCG-LZCG共有OTU 1459个。图1-a中ITS rRNA测序共获得 1135 553 对序列,质控、拼接后共产生 1129 295 条有效数据,每个样品至少产生 40 791 条有效数据,平均产生75 286 条有效数据,共产生2206个OTUs。其中LZCG组有1896个OTUs,LZTK组有1698个OTUs,PXCG组有1793个OTUs,PXTK组有1837个OTUs。PXTK-PXCG共有OTU 1526个,LZTK-LZCG共有OTU 1533个。PXTK-LZTK共有OTU 1439个,PXCG-LZCG共有OTU 1636个。由图1-b可知,土壤条件相同时,同一处理方式下微生物种类数量上更接近;相同土壤条件下的两个组间共有物种更多。土壤熏蒸会使三七根际土中细菌种类减少,添加生物菌剂不能改变细菌种类减少的程度。常规管理模式下熏蒸后真菌种类增加,熏蒸后添加生物菌剂会降低真菌种类。PXTK组特有细菌和真菌种类最多。

2.1.2 门水平微生物群落结构分析 门水平分类上,三七根际土壤细菌中的优势菌群依次为变形菌门(Proteobacteria,33.17%～53.70%),酸杆菌门(Acidobacteriota,25.90%～10.71%,)放线菌门(Actinobacteriota,3.81%～13.13%),芽单胞菌门(Gemmatimonadota,7.89%～14.73%),绿弯菌门(Chloroflexi,1.93%～4.25%),粘菌门(Myxococcota,1.16%～2.72%),厚壁菌门(Firmicutes,1.08%～2.07%),拟杆菌门(Bacteroidota,0.97%～8.03%)。以上8个菌门共占细菌总数的87.29%～91.8%。熏蒸使变形菌门、放线菌门、拟杆菌门的丰度上升,同时降低芽单胞菌门、酸杆菌门的丰度,此外,Methylomirabilota在熏蒸后几乎消失。熏蒸地添加菌剂并不能改变上述细菌门水平变化的趋势。

图1 不同组三七根际土壤中细菌和真菌群落OTUsFig.1 OTUs of bacterial and fungal community in rhizospere soil of P.notoginseng from different groups

门分类水平上,三七根际土壤真菌中的优势菌群依次为子囊菌门(Ascomycota,62.75%～64.35%),担子菌门(Basidiomycota,18.00%～20.24%),被孢霉(Mortierellomycota,6.30%～8.40%),unclassified_fungi(3.15%～5.66%),壶菌门(Chytridiomycota,1.72%～3.55%),罗兹菌门(Rozellomycota,1.13%～1.89%),油壶菌门(Olpidiomycota,0.27%～0.93%),球囊菌门(Glomeromycota,0.05%～0.17%)。以上8个菌门共占据真菌数量总数的99.60%～99.84%。子囊菌门、担子菌门在各组间的丰度排名为LZTK>PXCG>PXTK>LZCG。

2.1.3 属水平微生物群落结构分析 丰度排名前30的细菌属水平聚类热图(图2-a)显示同一组的样品距离接近,说明优势属的物种丰度在组间的相似性更高,不同组的差异更大。土壤条件相同的组聚为一类,熏蒸使三七根际土壤细菌的优势物种组成发生明显变化。处理方式相同土壤条件不同的两组间,优势菌属丰度排名均发生明显变化,说明熏蒸可能对未处理前的原始细菌菌群结构造成破坏,且这种破坏在采收时未能恢复至未熏蒸土的水平。

丰度排名前30的真菌属水平热图(图2-b)显示PXCG和LZCG的土壤真菌距离较接近,两组的组间差异也最小。其他组的样品则不能严格按照分组聚类。这可能是因为三七种植过程中施用的化学农药大多是广谱杀真菌剂,化学农药处理下土壤中丰度高的多为对农药抗性高的特定真菌物种。同样土壤条件下,TK组中镰刀菌、柱孢属(Cylindrocarpon)、链格孢属(Alternaira)和小不整球壳属(Plectospaerella)的丰度均低于CG组。

2.2 三七根际土壤菌群多样性分析

2.2.1 三七根际细菌α多样性分析 通过计算ACE指数、Chao1指数、辛普森指数和香农指数比较组间α多样性差异(表2～3)。除LZCG组Shannon指数高于PZCG组外,处理方式相同时,熏蒸使α多样性指数均有所下降。PXTK组4个α多样性指数在所有处理组中最高。LZCG组Simpson指数、Chao1指数、Shannon指数均显著高于LZTK组(P=0.006,0.011,0.001),PXCG组Shannon指数显著低于PXTK组(P=0.009)。Chao1指数和ACE指数估算群体OTU数/物种数,辛普森指数和香农指数考虑物种丰度加权,即考察丰富度的同时考虑物种的均匀度。处理方式相同时熏蒸处理会降低根际细菌菌群的辛普森指数,PX地上TK处理能有效改善细菌群落的不均衡发展提升均匀度。相反,LZ地上TK处理使得细菌α多样性指数有所下降。

2.2.2 三七根际真菌α多样性分析 细菌α多样性指数结果类似,LZTK组4个α多样性指数均最低。LZCG和PXCG组的Chao1值数和ACE指数高于LZTK和PXTK组。PX地上TK处理的Simpson指数和Shannon指数高于CG处理,LZ地TK处理则使真菌α多样性指数均低于CG处理。

2.2.3 细菌Beta多样性分析 PCoA图(图3-a)显示PXTK的样品更紧密地聚集在一起,PXCG的样品更分散,说明在PX地上TK处理较CG处理对根系菌群有更强的塑造作用。LZCG组样品更聚集,说明常规管理模式和熏蒸对土壤菌群的筛选有叠加作用,而菌剂的添加可以一定程度减缓这种作用。LZCG和LZTK、PXCG和PXTK的距离更接近,说明在PX地上处理方式不同对群落结构造成的差异更大。不同土壤条件的样本在PC1轴上完全区分,PC1轴解释度为64.5%;同样土壤条件下,TK处理与CG处理组的样品都能在PC2轴上区分开。使用置换多元方差分析(PERMANOVA)对不分组样品间的β多样性是否具有显著性差异进行检验。结果表明所有细菌样品组间差异大于组内差异(R=0.779),且检验可信度高(P=0.001<0.05)。说明处理方式和熏蒸均对三七根际细菌群落结构产生显著影响。

图2 根际土壤细菌(a)和真菌(b)属水平丰度Fig.2 The abundance of bacterial(a)and fungal(b) community in rhizosphere soil at genus level

表2 三七根际土壤细菌群落的Alpha多样性指数

表3 三七根际土壤真菌群落的Alpha多样性指数

图3 基于OTU水平三七根际土壤细菌群落PCoA分析(a)和真菌群落PLS-DA分析(b)Fig.3 PCoA analysis of bacterial communities(a)and PLS-DA analysis of fungal community(b) based on OTU levels in rhizosphere soils of P.notoginseng

2.2.4 真菌Beta多样性分析 基于OTU水平的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)结果(图3-b)显示不同组的真菌群落存在明显差异。其中LZCG组最紧密,组内差异小。LZCG与PXCG、PXCG与PXTK在component2(10.42%)轴和component3(9.16%)轴上均能完全区分开。PXCG与PXTK、LZCG与LZTK 在componet1(13.4%)轴上距离较远。菌剂和熏蒸剂均能在一定程度上解释三七真菌群落组成的改变。

2.3 多级物种差异分析

2.3.1 熏蒸地上处理方式不同造成的关键差异物种 基于线性判别分析,筛选出熏蒸地上处理方式不同造成显著差异的微生物。由图4-a可知,LZCG组显著富集Vicinamibacterales,芽单胞杆菌目(Gemmatimonadales)以及该目下的芽单胞杆菌科(Gemmatimonadaceae)和黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)的部分属。生物菌剂显著富集微球菌目(Micrococcales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales),以及上述3个目下的微球菌科(Micrococcaceae)、伯克氏科(Burkholderiaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)。

图4-b显示LZCG显著富集17个属的真菌,主要集中在伞菌亚门(Agaricomycetes)、盘菌亚门(Eurotiomycetes)以及油壶菌目(Olpidiales)。在LDA>3.0的水平下,没有找到LZTK的关键物种。

图4 多级分类水平下LZCG-LZTK组间细菌(a)和真菌(b)LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZCG and LZTK at multi-level classification

2.3.2 非熏蒸地上处理方式不同造成的关键差异物种 基于线性判别分析,筛选出非熏蒸地上处理方式不同造成显著差异的微生物。由图5-a可知,TK处理后起关键作用的细菌物种有伯克氏菌目、Pyrinpmonadales及该目下的Pyrinomonadaceae;CG处理的关键细菌物种集中在酸杆菌目(Acidobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)和芽单胞菌菌属(Gemmatimonas)。

图5-b显示CG处理显著富集的真菌物种种类较多且彼此亲缘关系较远,包括链格孢属、镰刀属、丛赤壳科、小不整球壳属、Staphylotrichum等病原菌属和Chaetpmiaceae、曲霉属(Aspergillus)等益生菌。PXTK组显著富集的真菌物种亲缘关系较分散,包括Tubefiaceae、酵母科(Saccharomycetaceae)、丝膜菌科(Cortinariaceae)以及Kazachstania、黏滑菇属(Hebeloma)等。

2.3.3 常规管理模式下熏蒸造成的关键差异物种 基于线性判别分析,筛选出常规管理模式下熏蒸造成的显著差异物种。图6-a显示,LZ地上富集的细菌物种集中在放线菌目(Actinomycetales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、Rhodanobacteraceae、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)。PX地上显著富集酸杆菌目(Acidobacteriales)、Vicinamibacterales、芽单胞菌目(Rokubacteriales)以及属于上述目下的芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、SC_I_84、unculured_Firmicutes_bacterium。

图6-b显示,LZ地显著富集的真菌物种集中在刺盾炱目(Chaetothyriales)、油壶菌科(Olpidiaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、丝膜菌科,以及属水平上的黏滑菇属、亡革菌属(Thanatephorus)、油壶菌属等。PX地显著富集的真菌物种有肉膜菌目(Helotiales)、Rhizophydiales、粪壳菌目(Sordariales)、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)以及属水平上的红曲霉属(Monascus)、Gorgonomyces。

2.3.4 生物菌剂处理下熏蒸造成的关键差异物种 基于线性判别分析,筛选出施加菌剂的管理模式下熏蒸造成的显著差异物种。由图7-a可知,同为TK处理,不同土壤条件下的关键细菌物种与同为CG处理时,不同土壤条件下的关键细菌物种相似。不同的是,LZTK还对微球菌科(Micrococcaceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)有富集作用。PXTK还对硝化螺旋科(Nitrosporaceae)、硝化螺旋属(Nitrospira)有富集作用。

图5 PXCG-PXTK组间细菌(a)和真菌(b)LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of bacteria and fungi between PXCG and PXTK at multi-level classification

图6 LZCG-PXCG组间细菌和真菌LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZCG and PXCG at multi-level classification

图7 LZTK-PXTK组间细菌和真菌LEfSe分析Fig.7 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZTK and PXTK at multi-level classification

表4 土壤理化性质

图7-b显示,LZTK仅对unclassified_Clavicipitaceae有富集作用。2.3.1项下没有计算出LZTK的关键物种,说明TK处理对LZ地上真菌的筛选和富集作用不明显。PXTK显著富集的真菌物种集中在球囊菌目(Glomerales)、Sporidioboales、unclassified_Agaricomycetes、白粉菌目(Erysiphales)、柔膜菌目以及这些目下部分科属。

2.4 三七土壤微生物群落与环境因子之间的相关性

由表4可知,除PXTK组AP含量略高于PXCG组,当土壤条件一致时,生物菌剂的施用均促进三七对营养元素的吸收。处理方式一致时,熏蒸降低土壤pH和有效氮的含量。不同土壤条件下,生物菌剂的添加对AP和AK的影响没有表现出一致的规律。

图8显示黄色杆菌科未分类属和芽单胞菌杆菌属与AP和AK正相关,Vicinamibacter和unclassified_Vicinamibaceraceae与pH正相关,与AN呈正相关的有芽单胞杆菌科,与AN呈负相关的有罗河杆菌属(Rhodanobacter)和鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)。pH与PXTK的细菌群落正相关,与LZCG和LZTK负相关。所有环境因子中,pH对细菌群落的影响最大,AN对细菌群落的影响最小。

图9显示与AP正相关性最强的是青霉属(Penicillium);与AK正相关的有曲霉属、镰刀属和unclassified_Agaricomycetes;与pH和AN正相关的有unclassified_Basidiomycota,Cladpsphaerina。pH对真菌群落结构的相关性最强,其中PXTK的真菌群落与pH呈正相关。

图8 土壤理化性质与细菌群落RDA分析 Fig.8 Redundant analysis of soil environmental factor and soil bacterial community

2.5 三七根际土壤真菌网络关系

该网络节点数为80,边数量为452,模块性为0.319。图10显示相关性排名前50的属之间,互相促进关系的网络是抑制关系的10倍之多,这可能导致了部分共生网络更发达的物种获得竞争优势不断积累,例如三七根腐病病原菌所在的镰刀属、链格孢属、土赤壳属(Ilyonectria)以及丛赤壳科等。种间促进关系网络过多往往不利于菌群的平衡,且更容易受到病原菌的侵袭[24],这可能也是三七连作过程中土壤逐渐从“细菌型”转向“真菌型”的原因之一。

图9 土壤理化性质与真菌群落RDA分析Fig.9 Redundant analysis of soil environmental factor and soil bacterial community

2.6 三七生长状况和根腐病发生情况

试验结束时,各组三七主要农艺性状见表5。熏蒸能够提高茎高和全根重。同样土壤条件下施加生物菌剂增加了剪口的重量同时对主根重量没有影响,其中PXTK组的剪口重量显著高于LZCG组。试验结束时PXTK、PXCG、LZCG、LZTK各组的三七植株存活率分别为70.7%、77.8%、75.4%、84.2%。施加生防菌剂和熏蒸都能提高根腐病的防效,其中LZTK组的存活率最高。

圆圈大小代表平均丰度大小,边的粗细代表相关性强弱,橙色代表正相关,绿色代表负相关(P<0.05)。The size of the circles represents the average abundance of species; The thickness of the edges represents the strength of correlation and the orange color represents positive correlation while green represents negative correlation(P<0.05).图10 三七根际土壤真菌间相关性网络Fig.10 Correlation network of soil fungi in rhizosphere of P.notoginseng

表5 三七生长状况

3 讨 论

土传病害的发生和根际微生物群落多样性密切相关,通常微生物群落多样性高,群落之间均衡发展的土壤中,土传病原菌较少[25]。生物菌剂的引入往往可以增加微生物的多样性,补偿性地改变病原菌积累对土著微生物的变化[26]。PXTK组在所有组中细菌α多样性指数均最高,以往的研究证实连作模式下三七根际土壤细菌α多样性逐年下降[27]。棉隆熏蒸会显著降低细菌α多样性,这与前人研究结果一致[28]。此外,本研究还发现熏蒸会增加真菌物种丰富度,而三七根际真菌的丰富度与幼苗移栽后的死亡率显著正相关[29]。真菌均匀度的降低,导致群落间的平衡性打破,将会影响土壤健康,使根腐病发生率上升[30]。PX地上菌剂的添加能够有效增加真菌群落的均匀度,但LZ地上添加菌剂未能出现一致的结果。

同样处理方式下,LZ地pH显著降低。土壤酸化有利于三七根腐病病原菌的生长,是三七连作障碍的诱因之一[8]。土壤pH与三七籽条移栽后的存活率呈正相关[31],与根腐病的发病率呈显著负相关[32]。RDA分析显示pH与群落之间的相关性最大,熏蒸显著降低了土壤pH,PXTK组pH最高。本试验选择的生物菌也是常见的根际促生菌(PGPR),可通过溶磷、固氮、影响植物激素分泌、诱导胁迫应答基因、诱导系统抗性等方式直接或间接提高作物产量[33-34]。试验结果显示土壤条件一致时,除了PXTK组AK含量与PXCG组相近,TK处理后的土壤有效氮、速效钾、速效磷含量均低于CG组。氮元素富集是三七种植过程中的常见问题,高浓度氮肥会提高镰刀菌属和链格孢属的丰度,同时降低芽孢杆菌和假单胞菌属的丰度[35],且会抑制三七的光合作用导致减产[36-37]。威百亩通过在土壤中降解为异氰酸甲酯发挥熏蒸灭菌作用,与棉隆的抗菌机制相同。前人研究发现威百亩会影响具有氮矿化等转化能力的土壤功能菌数量,从而妨碍氮循环过程[38]。杨馥霞等[39]发现熏蒸后土壤中具有固氮能力的慢生根瘤菌显著下降,熏蒸后应当补充益生菌和氮肥。本试验LZCG组中慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)的丰度较PZCG下降78.7%。威百亩、棉隆还会抑制反硝化菌从而进一步加深氮素累积[40-41]。相比PXCG组,硝化螺旋门(Nitrospirales)、硝化螺旋属在PXTK组中显著富集,且单因素方差分析显示其含量显著高于LZTK组,说明菌剂在土著菌群中的投入有利于维持三七土壤生态中氮元素的平衡。但本试验田测得碱解氮的含量均低于云南地区三七种植地碱解氮的平均值(142.58 mg/kg),而氮元素含量与三七块根和根条总皂苷含量正相关[42]。处理方式一致时土壤熏蒸均降低有效氮含量,是否应当在生产中补充氮元素缺失以避免药材有效成分的损失有待进一步实验研究。同样的处理条件,黄色杆菌科在连作地的丰度均显著提高,而同为连作地,黄色杆菌科则是农药处理组的关键物种。种植三七对土壤全磷有富集作用,且全磷含量与速效磷含量正相关[8],三七根际黄色杆菌科的丰度与磷元素正相关[43]。黄色杆菌属常被视为益生菌属,小米的产量与其在根际的丰度呈正相关[44],有研究认为病原真菌的增多能刺激植物茉莉酸通路进而诱导黄单胞菌(Xanthomona)在根际的富集从而使植物抗病性增强[45]。

棉隆与常规管理模式下预防三七根腐病的广谱杀真菌剂——福双美、代森锰锌、丙森锌等[46]同属于二硫代氨基甲酸酯类化合物,这可能会加剧熏蒸后部分对此类农药耐受性强的优势菌属的积累,使得菌群结构更为失衡。本试验结果显示,不同处理LZ地高丰度真菌物种高度一致,这些物种在LZCG和PXCG中的丰度高于LZTX和PXTK。其中曲霉属对镰刀菌属、链格孢菌属、土赤壳属等病原菌有较强的正相关性,从而成为加剧根腐病发生的隐患。LEfSe分析显示对比LZCG-LZTK、LZCG-PXCG,LZCG均显著富集鞘氨醇单胞属或鞘氨醇单胞菌科。鞘氨醇单胞属易于在连作地患病三七的根际富集,常被视为潜在的根腐病病原菌[27]。Wei等[47]通过LEfSe分析观察到孢腔菌科(Pleosporaceae)易在三七锈腐病根际土显著富集,Pyronemataceae、Xenopolyscytalum在健康三七根际土显著富集。PX地上施加菌剂显著降低了孢腔菌科的丰度,同时显著升高了Pyronemataceae、Xenopolyscytalum的丰度。Eo等[48]发现毁灭柱孢菌(C.decstructans)对棉隆有较高的耐受性,本试验也发现LZCG与PXCG中柱孢属的丰度接近,而其在PXTK的丰度仅为PXCG的1/10。此外,同样土壤条件下TK处理均能显著提升假单胞菌属的丰度,但木霉菌和芽孢杆菌的丰度增加没有显著性。益生菌剂的生物效果可能并非通过增加所选益生菌丰度,而是通过提升土著菌群网络整体的抑病能力和群落恢复能力发挥生物效果[49]。PXTK组提高了其他益生菌丰度。比如溶杆菌(Lysobacter)、伯克霍尔德菌等。溶杆菌对多种病原真菌、卵菌、细菌、线虫均具有溶菌活性[50]。伯克氏菌科能够抑制毁灭柱孢生长并讲解三七自毒物质[51]。

由于熏蒸剂对土壤微生物群落结构的破坏,病原菌二次感染率高是熏蒸剂防控效果差的主要原因[52],添加生物菌剂形成抑病区系往往能弥补其不足。张庆华等[53]发现熏蒸+生物菌肥处理抑制草莓病原菌属的同时可以增加部分有益菌并使微生物多样性恢复更快。杨柳等[54]也认为,棉隆熏蒸配施水肥菌可以降低初侵染来源并增加益生菌定殖率从而使得大棚番茄综合发病率极大的下降。然而熏蒸后添加生物菌并非一定起到增加抑病能力的效果。张立彭等[55]发现,威百亩和棉隆不能缓解百合连作障碍,熏蒸加益生菌剂对比单独熏蒸可以提高百合根系活力,但对百合增产的作用尚不及单独使用菌剂。这可能由于熏蒸剂对微生物群落结构功能的改变影响了土壤生态系统的稳定性,且微生物多样性很难恢复到原来水平[56]。本试验结果显示,PXTK与LZTK微生物群落结构的组成更接近,但熏蒸并没有增加生物菌剂对微生物多样性改变的作用。菌剂的施加在不影响三七地下重量的同时能够降低根腐病的发生,熏蒸后添加菌剂的管理模式有增加三七连作地抑病能力的潜能。

4 结 论

相较常规管理模式,在非熏蒸地上施用生物菌剂可以提高三七根际细菌群落α多样性和真菌群落均匀度。施用生物菌剂可以抑制棉隆熏蒸对真菌群落丰富度的提升,但不能改善熏蒸降低根际土壤细菌群落的丰富度和均匀度的效果。生物菌剂处理降低三七病原菌相对丰度的同时增加部分益生菌属的丰度,对菌群结构有较强的塑造能力,并能调节三七种植过程中造成的土壤营养元素失衡和土壤酸化问题。