感病羊肚菌内生细菌群落结构与多样性

谢文霖,杨 燕,于龙飞,蒋 萍,蒋海峰,罗金洲,余 马

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川 绵阳 621010;2.四川菌之味农业开发有限公司,四川 大邑 611330;3. 四川省烟草公司泸州市公司叙永分公司,四川 泸州 646400)

【研究意义】羊肚菌(MorchellaSPP.)属子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Pezizomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。据Emile[2]报道,羊肚菌属在世界范围内广泛分布,共有28种。卯晓岚[3]在《中国蕈菌》中记载已知羊肚菌属菌物在中国有10个种,主要分布在我国四川、云南、青海、河南、河北、黑龙江、辽宁、宁夏、新疆、江苏等。羊肚菌不仅具有风味独特和营养丰富的食用品质,《本草纲目》中记载其具有“甘寒无毒,益肠胃,化痰利气”的药用价值。因野生羊肚菌资源有限且受破坏十分严重,陆续在全国多地开展了羊肚菌人工栽培研究。四川具有复杂多样的地形地貌、良好的土壤和气候条件,为羊肚菌的生长发育提供了相对适宜的环境。近年来,四川在羊肚菌人工商业化栽培方面取得了突破性进展,种植规模和市场均居全国前列[4]。但随着羊肚菌产区面积的扩大,羊肚菌受到病害的影响加重,在进行人工栽培时羊肚菌绝产绝收时有发生[5]。【前人研究进展】内生菌(Endophyte)是指部分或全部生活史需生存于宿主组织的一类微生物[6],主要包括内生真菌和内生细菌,其中内生细菌是羊肚菌子实体中占比最多的微生物。现代植物内生菌的研究起源于对林木内生真菌和禾本科植物内生真菌的挖掘[7],邱德有等[8]从云南红豆杉中分离出可以合成抗癌化合物紫杉醇的内生真菌。国际上常见对禾本科植物的Epichloid内生真菌研究,在我国则重点围绕药用植物内生菌的生理活性物质进行生产上的应用性研究[9]。内生细菌对宿主具有中性共生、益生及毒害作用,目前对羊肚菌内生细菌的初步鉴定和内生真菌的多样性研究已有相关报道[10-11],证实内生菌与羊肚菌之间存在密切的共生关系,但感病羊肚菌子实体内生细菌的菌群结构尚未完全发掘且对其多样性研究仍处于初级阶段,因此对羊肚菌病害发生的微生物机制急需研究。张慧等[12]通过人工合成菌群促进了黄芪生长,高振峰等[13]通过内生拮抗细菌的筛选抑制了番茄灰霉病,羊肚菌与其内生菌之间存在共生关系,内生菌可以为其提供养分和保护,也为羊肚菌在人工栽培时实现稳产抗病提供了思路。羊肚菌内生菌群与子实体共同构成了一个复杂的生态系统,研究羊肚菌内生细菌可以了解该生态系统的多样性和功能[1]。【本研究切入点】通过高通量测序技术对四川感病羊肚菌内生细菌进行16S rDNA测序分析,从基因组水平评估感病羊肚菌子实体内生细菌的丰度、均匀度和多样性,开展感病羊肚菌内生细菌的群落结构与多样性的基础性研究,以期从内生菌角度抑制羊肚菌病害发生。【拟解决的关键问题】旨在揭示感病羊肚菌内生细菌的分布情况、菌群差异以及相关代谢功能,为羊肚菌的抗病生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

供试样本为羊肚菌(Morchellaesxtelata)新品种六妹羊肚菌,采自四川菌之味农业开发有限公司大邑羊肚菌种植基地。在种植基地中,以健康子实体(H组)为对照,将子实体污染变色面积占总表面积达25%、50%、75%、100%的感病子实体分别划分为轻度感病(D组)、中度感病(P组)、重度感病(C组)、完全感病(G组)共4组(图1)。每组设3次重复,每个重复5株子实体。每个重复内羊肚菌子实体混合装入无菌袋中进行干冰保存和运输,在实验室用75%乙醇进行子实体表面消毒,无菌水冲洗10次,0.1%氯化汞浸泡5 min,再次用无菌水冲洗,确保充分去除子实体表面的微生物残留,快速风干子实体表面,将子实体置于液氮中磨碎,存储于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2 羊肚菌内生细菌DNA提取及PCR扩增

对获得的羊肚菌子实体样品用Omega E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒提取内生细菌总DNA。使用上游引物338(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和下游引物806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)对16S rDNA V3～V4保守区基因片段进行PCR扩增,扩增产物回收纯化后进行荧光定量分析。

1.3 羊肚菌内生细菌高通量测序分析

采用Illumina公司的Miseq平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序,测序F端：AACMGGATTAGATACCCKG,测序R端：ACGTCATCCCCA CCTTCC,测序区域：16S rDNA的V3～V4区。序列去噪主要通过DADA2法,序列聚类选择Vsearch法。对序列质量进行质控和过滤,使用已知数据库SILVA132作为参考,通过去噪后的序列获得有效序列,并通过去除嵌合体序列得到最终可用的高质量序列,功能基因项目默认选择Vsearch法进行分析,委托上海派森诺生物信息科技有限公司完成高通量测序。

H：健株子实体,未感病;D：子实体感病表面积25%;P：子实体感病表面积50%;C：子实体感病表面积75%;G：子实体感病表面积100%。H： Healthy fruiting body, no disease; D： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 25%; P： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 50%; C： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 75%; G： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 100%.图1 羊肚菌子实体污染变色面积Fig.1 Discolored area contaminated by Morchella fruiting body

1.4 羊肚菌内生细菌生物信息学分析

使用QIIME2(2019.4)软件和Vsearch(v2.13.4)软件,分别获取样品在门、纲、目、科、属5个分类水平上的组成和丰度分布,使用R语言脚本及ggraph、ggplot2包等工具分析样品总体并绘制热图和聚类树图,使用PICRUSt2工具进行菌群代谢功能预测。使用ASV/OTU丰度表制作韦恩图,根据内生细菌在各组间的有无分别统计各个集合的成员数,对不同组的羊肚菌内生细菌界定共有和独有的内生细菌,最后进行样品组间群落差异分析。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌内生细菌测序结果与质量分析

羊肚菌子实体中的内生细菌总DNA经PCR扩增后进行产物回收纯化,回收产物荧光定量后进行高通量测序,对原始双端序列进行质量筛选,获得羊肚菌子实体内生细菌的有效序列量及高质量序列量(表1)。羊肚菌内生细菌有效的序列长度为363～384 bp,其中378 bp的序列最多,占比67.11%,其次为370 bp的序列,占比16.07%。该序列长度分布与16S rDNA V3～V4区序列长度吻合,测序达到分析要求且数据质量可靠(图2)。

2.2 羊肚菌内生细菌多样性分析

使用QIIME2软件进行物种分类学注释和扩增子序列变体(Amplicon sequence varian,ASV)表抽平,以100%相似度聚类并使用DADA2质控后产生去重的序列ASVs,将ASV丰度矩阵文件结果绘制成图。对总样本组内求平均值后,共注释得到5组ASV数,其中H、C、D、G组的ASV数目均在250～400,而中度感病的P组ASV数目最高,达1591(图3)。

ASV稀疏曲线可以评判样品测序深度是否足以反映该样本群落所包含的微生物多样性。伴随测序深度增加,ASV稀疏曲线趋于平缓,表明该测序结果已足够反映样品所包含的绝大部分微生物,继续增加测序深度无法检测到子实体中尚未发现的新ASVs(图4)。

表1 肚菌子实体内生菌测序统计

a：各长度下的序列数量,b：各长度的序列占比分布。a： Number of sequences at each length; b： Proportion distribution of sequences at each length.图2 羊肚菌内生细菌DNA序列长度数量及占比分布Fig.2 DNA sequence length quantity and proportion distribution of endophytic flora in Morchella

Alpha多样性分析表明,Chao1指数和可观测物种(Observed species)指数作为表征丰富度的指数和操作分类单元数相同,说明测序结果足够反映样品的菌群丰度,且5组(H、D、P、C、G)内生菌丰度无显著差异(P>0.05),P组Chao1平均指数为1611,内生菌丰富度最大,健康羊肚菌菇体的H组Chao1平均指数为328,内生菌丰富度最小,根据上述指数对组间菌群丰度大小进行排序：P组>G组>D组>C组>H组;Shannon指数和Faith’s PD指数分别表征多样性及基于进化的多样性。虽然各组存在羊肚菌感病程度的不同,但2种指数在羊肚菌子实体内生细菌组间进行差异性分析时,内生菌的多样性并无显著差异(P>0.05),羊肚菌菇体半黑的P组shannon平均指数为6.8,该组样品内生菌菌群多样性最高,羊肚菌菇体全黑的G组Shannon平均指数为3.2,该组样品内生菌菌群多样性最低(图5)。根据Shannon指数对菌群多样性高低进行排序为P组>H组>D组>C组>G组。

图3 羊肚菌内生细菌ASV划分和分类地位鉴定统计Fig.3 ASV classification and classification status identification statistics of endophytic flora in Morchella

图4 羊肚菌内生细菌ASV数的稀疏曲线Fig.4 Sparse curve of ASV number of endophytic flora in Morchella

图5 羊肚菌内生细菌Alpha多样性相关指数Fig.5 Alpha diversity correlation index of endophytic flora in Morchella

由图6可知,P组样品曲线最宽,表示物种的组成最丰富;物种组成的均匀程度由曲线的曲度来反映,P组样品均匀程度最低,其余4组羊肚菌子实体内生细菌组成的均匀程度较高。内生细菌菌群均匀度排序为H组>C组>D组>G组>P组。

图6 羊肚菌内生细菌丰度等级曲线Fig.6 Abundance grade curve of endophytic flora in Morchella

2.3 羊肚菌内生细菌群落组成分析

羊肚菌内生细菌主要包括3门7纲10目17科28属(图7)。从门水平来看,H组未感病羊肚菌的内生细菌主要归类于变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占总数的55.81%和42.57%。厚壁菌门(Firmicutes)的内生细菌仅在感病羊肚菌子实体中出现,轻度感病的D组和中度感病的P组羊肚菌内生细菌主要属于变形菌门(Proteobacteria),分别占其所属组总数的73.51%和72.29%,其次是拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占其所属组总数的17.50%和25.96%,其中厚壁菌门的内生细菌在P组羊肚菌子实体内占比最高,占该组总数的7.50%。重度感病的C组和完全感病的G组羊肚菌的内生细菌主要属于变形菌门(Proteobacteria),分别占其所属组总数的96.64%和98.36%。说明,变形菌门在健株子实体中和拟杆菌门占比接近,在感病子实体中随感病程度加剧而占比升高。拟杆菌门则呈相反趋势。

在纲水平上,H组健株子实体优势菌纲主要是γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和拟杆菌纲(Bacteroidia),所占比例分别是55.33%和42.57%。芽孢杆菌纲(Bacilli)的内生细菌仅存在于感病程度中度及以上的羊肚菌子实体中,在重度感病的C组及完全感病的G组羊肚菌子实体中该纲内生细菌占比分别为2.18%和0.20%,在中度感病的P组中占比最高,为7.49%。从目水平来看,羊肚菌子实体在中度感病前,H、D、P 3组内生细菌存在三大类优势内生细菌,主要属于假单胞菌目(Pseudomonadales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)和β-变形菌目(Betaproteobacteria),重度感病程度以上的羊肚菌子实体中只存在1种假单胞菌目(Pseudomonadales)的优势内生细菌,在C组和G组中占比同为95.8%。

从属水平来看,H、P、D组的内生细菌大部分属于假单胞菌属(Pseudomona),分别占其所属组总数的46.92%、47.59%和59.79%,其次是黄杆菌属(Flavobacterium),分别占其所属组总数的41.07%、10.90%和25.92%。P组的内生细菌中还含有相当数量的八叠球菌属(Sporosarcina)和金黄杆菌属(Chryseobacterium),占比分别为6.54%和6.13%。C组、G组的内生细菌主要属于假单胞菌属(Pseudomona),分别占其所属组总数的95.88%和95.79%。说明,随着感病程度的加深,羊肚菌内生细菌属的数量呈先上升后下降趋势,中度感病时其群落组成最丰富,在完全感病时群落组成较单一。

A～E分别表示在门、纲、目、科、属水平的群落分布。A to E represent the community distribution at phylum, class, order, family and genus levels, respectively.图7 羊肚菌内生细菌群落分类学组成和分布Fig.7 Taxonomic composition and distribution of bacterial communities at each level of endophytic morels

2.4 羊肚菌内生细菌群落差异分析

5组样品间共有的ASV/OTU的个数为40,H组健株羊肚菌子实体内生细菌中独有的ASV数目最小,为369;感病中期的P组独有的ASV数目最大,为3144;完全感病的G组独有的ASV数目次大,为556(图8)。

对平均丰度前20位的属丰度数据绘制热图,并根据样本组间的相关性绘制聚类树。重度感病的D组与完全感病的G组内生细菌群落相关程度最高,即菌群差异最小。感病中期的P组样品与其余4组样品的内生细菌群落均有相关性,表明该组样品内生菌群结构可能处于调整转换的关键期(图9)。

图8 羊肚菌内生细菌群落差异分析Fig.8 Differences of endophytic bacterial communities in Morchella

图9 羊肚菌内生细菌组成Fig.9 Endophytic bacterial composition in Morchella

2.5 羊肚菌内生细菌群落功能预测

PICRUSt2的KEGG预测分析中,羊肚菌子实体内生细菌大部分属于生物合成功能类,其中,控制辅酶因子合成以及维生素代谢功能类群的相对丰度最高,价值为69;其次是同化降解功能类群,其中芳香族化合物降解功能类群的相对丰度最高,价值为43;解毒功能类群占比最低,价值为4,其中包含甲醇转换二氧化碳的功能类群,价值为1(图10)。

3 讨 论

何培新等[14]分离不同发生地粗柄羊肚菌的内生真菌,用常规形态学技术和ITS序列分析进行鉴定,从3处发生地采集的羊肚菌子实体中共分离出属于14个分类单元的16个内生真菌菌株,其中仅1个菌株(高山被孢霉)属于接合菌门,其余15个菌株为子囊菌或无性型,毛壳菌为3个发生地共有的内生真菌,Lecanicilliumfungicolavar.aleophilum仅在四川绵阳和河南郑州采集的羊肚菌子实体中分离到,表明羊肚菌内生真菌具有多样性。在同一生态位下,真菌和细菌都与羊肚菌存在共生关系,两者的不同功能和多样性共同维系着羊肚菌子实体内的生态平衡。沈洪等[15]对羊肚菌内生细菌进行DGGE鉴定,测序共得到7种内生细菌,主要属于变形菌门和拟杆菌门,DGGE鉴定在一定程度上反映羊肚菌内生细菌的群落结构,该结果也与本研究H组健株羊肚菌内生细菌群落组成吻合。杜晓宁等[16]对枸杞内生细菌进行16S rRNA基因测序分析发现,枸杞中存在的可培养内生细菌具有丰富的多样性,其对枸杞的病原菌具有一定的抑菌活性。针对本研究羊肚菌子实体中存在的内生细菌,下一步应分离出可培养的内生细菌以便进行后续的抑菌活性实验。阳湖荣等[17]对菌根植物白术的内生细菌进行16S r DNA分析,结果表明白术内生细菌中共有11个属,假单胞菌属占优势地位,其中分离出的菌株大多数具有固氮和解钾作用。本研究发现,羊肚菌的优势内生细菌主要属于3门7纲10目20科30属。在门水平上丰度最高的是变形菌门,在科水平上丰度较高的是假单胞菌科、黄杆菌科,在属水平上丰度较高的是假单胞菌属和黄杆菌属。本研究表明,不同感病程度的羊肚菌子实体内生细菌丰富度、多样性、均匀度虽各有差异,但多样性指数差异都未达到显著水平,这可能与四川地方性土壤、气候、温度等环境条件和栽培方式相近有关,通过本研究可初步明确四川羊肚菌子实体内生细菌的多样性和感病后内生细菌多样性的变化。

目前对内生细菌代谢功能与宿主生长发育关系等的研究较多。内生细菌可固定空气中的氮[22],产生植物生长素[23]、酶[24]等,可直接促进植物生长发育,同时能合成细胞壁裂解酶等物质抵抗病菌侵入,间接促进植物生长发育[18-19]。从茅苍术中分离到可产生IAA的内生细菌[20],从中华补血草中分离到产ACC脱氨酶的内生细菌[21],均可促进植物的生长。本研究对子实体内生细菌的基因功能和代谢途径进行初步分析,结果表明功能类群中的生物合成功能在羊肚菌样品中的相对丰度最高,其中,芳香族化合物的代谢功能相对丰度较高,其次是维生素代谢功能类群,与抗菌作用有关的功能类群丰度值最小,为今后研究羊肚菌内生细菌代谢产物多样性和生防菌的开发提供一定的理论基础。未感病羊肚菌子实体内生菌群均匀程度最高,表明其内生细菌的菌群结构合理,有利于羊肚菌正常的生长发育;感病后,羊肚菌子实体中均出现了厚壁菌门的内生细菌,表明厚壁菌门内生细菌起到一定的抗逆作用;中度感病的羊肚菌子实体内生细菌丰富度指数和多样性指数最高,表明内生细菌菌群趋于饱和,有关菌群积极参与抗逆过程但是未能阻止感病程度继续加深,可以针对该组样品的厚壁菌门内生细菌进行分离培养和鉴定,可能获得羊肚菌抗病菌群;完全感病的羊肚菌子实体内生菌优势菌群基本转变为假单胞菌属,多样性指数最低,表明羊肚菌被该属病菌基本侵染且菌群结构单一。功能预测结果表明,羊肚菌子实体内生细菌中多数菌群与生物代谢相关,与生物同化降解功能和解毒功能的相关性次之。

横坐标为各功能类群在样品内的相对丰度,纵坐标为KEGG第二等级功能类群。The abscissa is the relative abundance of functional group, and the ordinate is the KEGG second-level functional group.图10 羊肚菌内生细菌基于KEGG功能的丰度分布Fig.10 KEGG secondary distribution of of endophytic flora in Morchella

4 结 论

本研究通过16S rDNA测序分析明确了羊肚菌健株和感病株其子实体内生细菌的群落结构组成,明确了假单胞菌属和黄杆菌属为羊肚菌内生细菌的优势属,在感病程度加重时假单胞菌属的内生细菌比例逐渐上升,而黄杆菌属内生细菌呈下降趋势,在健株子实体中黄杆菌属与假单胞菌属细菌呈同等优势属地位。中度感病组多样性指数最高,完全感病组多样性指数最低,对羊肚菌子实体内生细菌优势属的平衡调控可能有助于其健康生长。