气相色谱法测定葛根和淫羊藿总黄酮提取物中大孔树脂有机残留物

郭韵妍 郝娟 招嘉文 任宾 周莹乐 胡时先 王菩彦

（1.国药集团德众〔佛山〕药业有限公司，广东佛山528000；2.新疆华春生物药业股份有限公司，新疆乌鲁木齐830000）

【摘要】目的：建立葛根和淫羊藿总黄酮提取物中大孔吸附树脂7种有机残留物的含量测定方法。方法：采用气相色谱法，DB-1毛细管柱（柱长为60 m，内径为0.25 mm，膜厚度为1.0μm），柱温为程序升温，起始温度为40℃，再以4℃/min升温至175℃，保持12 min，用氢火焰离子化检测器检测，检测器温度250℃，进样口温度200℃；载气为氮气，流速为0.8 mL/min，分流比为20∶1，顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为50 min。结果：7种有机溶剂残留物的峰面积与浓度呈良好线性关系，正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、1，2-二乙基苯的平均回收率分别为101%、90%、87%、85%、84%、76%、79%。结论：该方法测定准确度高、精密度重复性好。

【关键词】葛根和淫羊藿总黄酮提取物；大孔树脂有机残留物；气相色谱法；顶空进样

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.01.011

Determination of Macroporous Resin Organic Residues in Total Flavonoids Extracts of Pueraria lobata and Epimedium grandiflorum by Gas Chromatography

GUO Yunyan1， HAO Juan2*， ZHAO Jiawen1， REN Bin2， ZHOU Yingle1， HU Shixian2， WANG Puyan2

（1. National Pharmaceutical Group dezhong〔Foshan〕Pharmaceutical Co.，Ltd.， Foshan 528000， China； 2. Xinjiang Huachun biopharmaceutical Co.， Ltd.， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of 7 kinds of organic residues in the total flavone extracts of radix puerariae and epimedium by macroporous adsorption resin. Method： Gas chromatography was used. DB-1 capillary column （column length： 60 m， inner diameter： 0.25 mm， membrane thickness： 1.0μm）；The column temperature is programmed， the initial temperature is 40℃， and then the temperature is increased to 175℃at 4℃/min per minute for 12 min The detector temperature is 250℃， which is detected by hydrogen flame ionization detector； Injection port temperature 200℃； The carrier gas is nitrogen， and the flow rate is 0.8mL/min. The split ratio is 20∶1. For headspace injection， the equilibrium temperature of the headspace bottle is 90℃and the equilibrium time is 50 min. Results： There is a good linear relationship between the peak areas and concentrations of the residues of seven organic solvents. The average recoveries of n-hexane， benzene， toluene， xylene， styrene， divinylbenzene， 1，2-diethylbenzene are 101%， 90%， 87%， 85%， 84%， 76%， 79%， respectively. Conclusion： The method has high accuracy and repeatability.

Keywords： extracts of total flavonoids from kudzu root and epimedium； organic residue of macroporous resin； gas chromatography； headspace injection

孔吸附樹脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体，乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为致孔剂，相互交联聚合形成的多孔骨架结构。大孔吸附树脂技术的引进，使中草药有效单体成分或复方中某一单体成分的指标得到提高。该技术具有快速、高效、方便、灵敏、选择性好等优点。国内外对大孔吸附树脂溶剂残留问题有相应的规定，但内容不全，部分品种无树脂残留检测，缺少树脂相关通用性技术指导原则，行业标准更新缓慢[1]。新疆华春生物药业公司上市的发挥抗抑郁作用的参葛补肾胶囊所需要的葛根和淫羊藿总黄酮提取物，以葛根和淫羊藿饮片按比例以乙醇提取浓缩，经AB-8大孔树脂吸附而得到的提取物[2-3]。大孔树脂常见的残留溶剂包括苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷。本研究拟建立葛根和淫羊藿总黄酮提取物中大孔吸附树脂7种有机残留物的顶空气相色谱法检测方法，并在已建立的色谱条件下，检定3批葛根和淫羊藿总黄酮提取物大孔树脂的有机溶剂残留量，为完善葛根和淫羊藿总黄酮提取物质量控制方法奠定试验基础。

气相色谱仪（Agilent 7890B）；纯水机（明澈TM-D24UV Millipore密理博）；电子天平（CP225D赛多利斯科学仪器〔北京〕有限公司）；电子天平（BS224S赛多利斯科学仪器〔北京〕有限公司）。正己烷（ALADDIN，C1721099，>99.5%）；苯（Macklin，C13811713，99.9%）；甲苯（佛山西陇，B220701-1，99.5%）；二甲苯（ALADDIN，G1731074，>99.9%）；苯乙烯（Macklin，C13723410，>99.5%）；1，2-二乙基苯（西亚试剂，20220719，99%）；二乙烯苯（西亚试剂，20220419，99.5%）；N，N-二甲基乙酰胺（Fisher chemical，HPLC级，220465）。

2.1色谱条件与系统适用性试验

以DB-1毛细管柱（柱长为60 m，内径为0.25 mm，膜厚度为1.0μm）；柱温为程序升温，起始温度为40℃，再以4℃/min升温至175℃，保持12 min，用氢火焰离子化检测器检测，检测器温度250℃；进样口温度200℃；载气为氮气，流速为0.8 mL/min。分流比为20∶1。顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为50 min。

2.2对照品溶液的制备

精密称取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯对照品适量，加N，N-二甲基乙酰胺制成成每1 mL中分别含20μg、2μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg的溶液，作为对照品贮备液。精密吸取上述贮备液2 mL，置于100 mL量瓶中，加5%N，N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于20 mL顶空瓶中，密封，即得。

2.3供试品溶液的制备

取本品约0.1 g，精密称定，置于20 mL顶空瓶中，精密加入5%N，N-二甲基乙酰胺溶液5 mL，密封，摇匀，即得。

2.4测定方法

分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液（5%N，N-二甲基乙酰胺溶液）、顶空气体1 mL，注入气相色谱仪，测定，即得。

2.5分析方法考察

2.5.1专属性考察

供试品溶液：取供试品按“2.3供试品溶液的制备”制备葛根淫羊藿总黄酮提取物树脂残留用供试品溶液。

对照品溶液：称取正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯、苯加N，N-二甲基乙酰胺，制成每1 mL中含正己烷22.0691μg、甲苯21.9895μg、二甲苯21.4585μg、苯乙烯25.4123μg、1，2-二乙基苯22.6908μg、二乙烯苯22.1487μg、苯2.1139μg的对照品储备溶液。精密吸取上述貯备液2 mL，置于100 mL量瓶中，加5%N，N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于20 mL顶空瓶中，密封，即得。

阴性对照溶液：以5%N，N-二甲基乙酰胺溶液作为空白溶剂溶液。分别精密量取顶空气体1 mL，注入气相色谱仪，测定，即得。结果表明，对各种残留溶剂定位并进行混合溶剂的分离度试验，分离度大于1.5。同时空白溶剂对被测溶剂无干扰。空白溶剂中与对照溶液相应的保留时间没有色谱峰，说明空白溶剂对树脂残留溶剂的测定无干扰，且各目标色谱峰与相邻色谱峰分离度均符合要求（见图1—图4）。这说明以本法测定葛根淫羊藿总黄酮提取物的树脂残留具有专属性。

2.5.2系统适用性考察

精密称取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯，置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基乙酰胺使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中含正己烷22.0691μg、甲苯21.9895μg、二甲苯21.4585μg、苯乙烯25.4123μg、1，2-二乙基苯22.6908μg、二乙烯苯22.1487μg、苯2.1139μg的对照品储备溶液。精密吸取上述贮备液2 mL，置于100 mL量瓶中，加5%N，N-二甲基乙酰胺溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于20 mL顶空瓶中，密封，即得。分别精密量取顶空气体1 mL，注入气相色谱仪，测定6次，即得，结果见表1。

结果表明，色谱图中各目标色谱峰与相邻色谱峰分离度符合要求（分离度大于1.5）；对照品溶液连续进样6次，RSD均小于10%。本方法测定葛根淫羊藿总黄酮提取物树脂残留系统适用性结果符合要求。

2.5.3标准曲线制备及线性关系考察

对照品储备液的制备。称取正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯，加N，N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，制成每1 mL中含正己烷22.0691μg、甲苯21.9895μg、二甲苯21.4585μg、苯乙烯25.4123μg、1，2-二乙基苯22.6908μg、二乙烯苯22.1487μg、苯2.1139μg的对照品储备溶液。

精密吸取该对照品储备溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5、3.5、4 mL分别置于100 mL量瓶中，上述各量瓶分别加5% N，N-二甲基乙酰胺至刻度，摇匀，制成7个浓度系列的对照品溶液。精密量取5 mL，置20 mL顶空瓶中，密封，即得。

分别精密吸取7个浓度系列的对照品溶液顶空气体1 mL，注入气相色谱仪，按既定色谱条件下进样测定，测定各自峰面积。以进样浓度X（μg·mL-1）对应峰面积Y进行线性回归，结果见表2。

结果表明，苯在0.010570～0.084556μg/mL、正己烷在0.110346～0.882764μg/mL、甲苯在0.109948～0.879580μg/mL、二甲苯在0.107292～0.858340μg/mL、苯乙烯在0.127062～1.016492μg/mL、1，2-二乙基苯在0.113454～0.907632μg/mL、二乙烯苯在0.110744～0.885948μg/mL范围内有良好的线性关系。

2.5.4精密度试验

2.5.4.1重复性试验

取同一批葛根和淫羊藿总黄酮提取物（批号：G21003）6份，分别按“2.3项供试品溶液的制备”制成6份供试品溶液。测定每一份含量，每份测定1次。结果样品中平均含量：1，2-二乙基苯为0.000024%，RSD为7.6%；甲苯为0.000021%，RSD为9.7%，其余均未检出，表明本测定方法的重复性良好。结果见表3、表4。

2.5.4.2中间精密度

不同操作人员分别取同一批次葛根淫羊藿总黄酮提取物（批号：G21003）2份，按“2.3供试品溶液制备方法”制成4份供试品溶液。測定每份含量，每份测定1次。结果测定的样品中平均含量。检验员A：1，2-二乙基苯为0.000024%，检验员B：1，2-二乙基苯为0.000020%，两者之间RSD=9.1%。检验员A：甲苯为0.000020%，检验员B：甲苯为0.000020%，两者之间RSD=0。这表明本测定方法中间精密度良好。结果见表5。

2.5.5准确度试验

取已知含量的葛根淫羊藿总黄酮提取物（批号：G21003）6份，每份0.1 g，置于20 mL顶空瓶中，分别精密加入混合对照品溶液（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙基苯的浓度分别为：0.441382、0.042278、0.439790、0.429170、0.508246、0.453816、0.442974μg·mL-1）5 mL，摇匀，定容，即得。按既定色谱条件下进样1 mL测定。计算加样回收率。加样回收率的计算公式为：

式中，A为供试品所含被测成分量；B为加入对照品量；C为待测品测得浓度。

各份样品的回收率情况见表6。

从表6中可知，回收率分别为：正己烷平均回收率为101%，RSD为5.0%；苯平均回收率为90%，RSD为4.3%；甲苯平均回收率为87%，RSD为3.4%；二甲苯平均回收率为85%，RSD为3.0%；苯乙烯平均回收率为84%，RSD为2.8%；1，2-二乙基苯平均回收率为79%，RSD为3.7%；二乙烯苯平均回收率为76%，RSD为2.2%，因而该方法的准确度良好。

2.5.6耐用性试验

2.5.6.1稳定性试验

称取葛根淫羊藿总黄酮提取物7份（批号：G21003），每份0.1 g，置于20 mL顶空瓶中，分别精密加入混合对照品溶液（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙基苯的浓度分别为：0.441382、0.042278、0.439790、0.429170、0.508246、0.453816、0.442974μg·mL-1）5 mL，密封，摇匀，即得。

按既定色谱条件下进样1 mL测定。供试品溶液（批号：G21003），分别于0、6、12、18、24、33、39 h时间点测定，测得各目标峰峰面积结果表7所示，结果表明供试品溶液在39 h内完成测定，测得数据稳定。

2.5.6.2顶空条件微小变动的影响

取葛根和淫羊藿总黄酮提取物（批号：G21003），分别按“2.3供试品溶液制备方法”制成4份供试品溶液，测定每份的含量，每份测定1次。

顶空条件设置为：1）顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30 min；2）顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为40 min；3）顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为50 min；4）顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为30 min。其余同“2.1”项下色谱条件。结果见表8。

2.5.7检测限和定量限

将苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、1，2-二乙基苯、正己烷各对照品储备液分别逐步稀释，精密取5 mL置于20 mL顶空瓶中密封，精密量取顶空气体1 mL，注入气相色谱仪，测定。按照对照品溶液色谱图中的各成分峰高折算，直到检测峰高为基线噪声的3倍左右为止（即S/N=3），计算各个成分的最低检测限。当检测峰高为基线噪声的10倍左右（即S/N= 10），计算各成分的最低定量限，结果见表9。

取以上不同浓度的对照溶液进行测定，根据惯例约定本分析方法的检测限是信噪比约为（3～5）∶1时相应溶液的浓度，定量限是信噪比约（10～15）∶1时相应的溶液浓度。结果：苯的检测限为0.001755μg·mL-1，定量限为0.004772μg·mL-1；正己烷的检测限为0.018317μg·mL-1，定量限为0.048131μg·mL-1；甲苯的检测限为0.002749μg·mL-1，定量限为0.010995μg·mL-1；二甲苯1的检测限为0.026823μg·mL-1，定量限为0.035031μg·mL-1；二甲苯2的检测限为0.004292μg·mL-1，定量限为0.017811μg·mL-1；二甲苯3的检测限为0.010729μg·mL-1，定量限为0.017811μg·mL-1；苯乙烯的检测限为0.003177μg·mL-1，定量限为0.127062μg·mL-1；1，2-二乙基苯的检测限为0.001475μg·mL-1，定量限为0.011345μg·mL-1；二乙烯苯1的检测限为μg·mL-1，定量限为0.048514μg·mL-1；二乙烯苯2的检测限为0.036158μg·mL-1，定量限为0.001440μg·mL-1；二乙烯苯3的检测限为0.004430μg·mL-1，定量限为0.018383μg·mL-1；二乙烯苯4的检测限为0.003765μg·mL-1，定量限为0.027686μg·mL-1。

2.5.8样品测定

取3个批次葛根和淫羊藿总黄酮提取物（批号：G21001、G21002、G21004）各2份，分别按2.3规定的方法制成2份供试品溶液。测定每份的含量，每份测定1次，结果样品中平均含量显示，葛根淫羊藿总黄酮提取物G21001：未检出；葛根淫羊藿总黄酮提取物G21002：1，2-二乙基苯为0.00002%；葛根淫羊藿总黄酮提取物G21004：1，2-二乙基苯为0.00005%，其余均未检出。

本研究在葛根淫羊藿总黄酮提取物样品4个批次中仅G21003检出甲苯和1，2-二乙基苯，且所含成分很低，甲苯为0.021329μg·g-1，1，2-二乙基苯为0.024376μg·g-1，小于国家标准规定限度。

由于二乙烯苯在色谱中有4个峰[4]，在精密度試验、线性方程、检测限和定量限以及回收率试验中均以4个峰的加和进行计算。

随着中药新药注册技术要求的不断提高，建立中药产品以及中药新药中涉及树脂纯化工艺的树脂残留物检测方法，具有较高的参考意义，可为药品的安全性提供质量保证。

【参考文献】

[1]王丹丹，刘芫汐，左甜甜，等.大孔吸附树脂及其在中药领域应用研究进展[J].中国药事，2022，36（7）：826-835.

[2]余煊，王欣佩，雷帆，等.太子参葛根淫羊藿复合物抗抑郁作用：与NRSF/NRSE-TPH2信号相关（英文）[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2021，30（1）：27-41.

[3]余煊.基于脑内5-HT探讨太子神悦抗抑郁的作用机制[D].北京：清华大学，2019.

[4]马国萍，陈丹，黄群，等.玳玳果降脂提取物中大孔吸附树脂有机残留量的顶空气相色谱分析研究[J].福建医科大学学报，2017，51（6）：375-380.

【作者简介】

郭韵妍，女，1989年出生，主管药师，学士，研究方向为药物分析方法开发。

通讯作者：郝娟，女，1983年出生，高级实验师，学士，研究方向为药物分析方法开发及新药研究，联系电话：15894084869，邮箱：863312511@qq.com。

（编辑：侯睿琪）