原发性醛固酮增多症的分子机制研究进展

蒋怡然， 王卫庆

（上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科 上海市内分泌代谢病研究所国家代谢性疾病临床医学研究中心（上海） 国家卫健委内分泌代谢病重点实验室上海市内分泌肿瘤重点实验室，上海 200025）

原发性醛固酮增多症是继发性高血压最常见的形式，早期诊断和治疗对预防不良心血管结局至关重要。近年来，随着分子诊断进展，发现驱动醛固酮合成的基因胚系和体系突变是导致疾病发生的主要机制。本文将阐述原发性醛固酮增多症的分子机制及基于机制的动物模型。

基因突变与原发性醛固酮增多症

一、 内向整流型钾离子通道亚家族J 成员5（recombinant potassium inwardly rectifying channel subfamily J, member 5，KCNJ5）基因

2011 年，Choi 等[1]在22 例醛固酮腺瘤（aldosterone-producing adenomas，APA） 患者中发现8 例KCNJ5体细胞突变。 人类KCNJ5基因编码G 蛋白耦联内向整流钾离子通道4 蛋白（G proteincoupled inwardly-rectifying potassium channels 4,GIRK4），APA 组织中KCNJ5突变导致GIRK4 蛋白结构和功能改变，最常见的突变包括p. Gly151Arg、p. Thr158Ala、 p. Leu168Arg，位于通道选择性过滤器区域，突变使钾离子选择性缺失，增加钠离子渗透性，因电压-门控钙离子通道开放导致膜去极化，激活钙离子信号通路， 并最终增加醛固酮合成酶（aldosterone synthase,CYP11B2） 表达和醛固酮生物合成。

KCNJ5体细胞突变在APA 中最为常见， 西方国家报道APA 中KCNJ5突变率约40%[2-3]， 在亚洲国家更高，为60%～77%[4-5]。KCNJ5突变的腺瘤患者更年轻，女性多见，血醛固酮水平更高，肿瘤体积更大。 Cao 等[6]通过二代测序发现KCNJ5突变率为80.7%，同时发现10 个新的显著突变基因（significantly mutated genes, SMG），并提出APA 基因表达谱， 为原发性醛固酮增多症进一步分子分型奠定基础。 相比其他突变，携带KCNJ5突变的APA 表达CYP11B1 细胞比例更高，但CYP11B2 及GIRK4 蛋白表达较低[7]。 也有研究表明KCNJ5突变是肾上腺切除术后手术获益的标志[8]。KCNJ5胚系突变与家族性醛固酮增多症Ⅲ型 （familial hyperaldosteronism Ⅲ,FH-Ⅲ）相关。 2008 年，FH-Ⅲ首次被描述， 临床表现为严重早发性高血压伴低钾血症[9]，之后在此患者中鉴定出KCNJ5基因种系突变[1]。在FH-Ⅲ家系中观察到不同严重程度的醛固酮增多症，部分患者严重程度与KCNJ5突变类型相关[10]。体外研究表明， 高剂量钙通道阻滞剂维拉帕米或大环内酯类药物可以阻断突变的GIRK4， 从而降低CYP11B2 表达和醛固酮合成[11]。 目前已有针对该现象进行的临床研究， 以评估大环内酯类药物用于KCNJ5突变的APA 的无创诊断及靶向治疗效果[12]。

二、L-型电压依赖性钙离子通道α1D 亚基（calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1D subunit，CACNA1D） 和T-型电压依赖钙离子通道α1H 亚基（calcium channel, voltage dependent,T-type, alpha 1H subunit，CACNA1H）基因

CACNA1D基因编码L 型钙通道Cav1.3 的α1亚单位，包含4 个重复结构域（Ⅰ～Ⅳ），每个重复结构域有6 个跨膜段（S1～S6）。 这些改变的残基位于S6 片段中沿沟道孔排列，突变影响Cav1.3 通道多种特性， 包括延迟电压门控依赖的失活状态或者在低水平去极化情况下诱导通道开放， 细胞内钙离子聚集，醛固酮大量合成，导致APA 发生[13-14]。利用CYP11B2 免疫组化引导的高通量测序发现该突变在美国、 法国及非裔APA 患者中分别为21%、37%和42%[15-16]。而在2 例严重早发醛固酮增多症患儿中发现CACNA1D的新种系突变，该醛固酮增多症与复杂的神经障碍[原发性醛固酮增多症、癫痫发作和神经异常（syndrome of primary aldosteronism, seizures and neurologic abnormalities，PASNA）]相关[17]。

CACNA1H基因转录翻译T 型钙离子通道Cav3.2， 该基因的胚系突变影响Cav3.2 通道特性，诱导其功能增强，导致钙离子内流增加，激活钙信号通路，是FH-Ⅳ的发病基因。一项研究发现5 例患儿具有CACNA1H的p.Met1549Val 位点突变，在10 岁前就出现APA[18]，其中2 例患儿伴有发育迟缓或注意力缺陷障碍。 在家族遗传的成人患者中也同样发现了CACNA1H的胚系突变[19]。在一项75 例APA 患者研究中发现3 例CACNA1H的体细胞突变[20]， 提示该基因突变在散发APA体细胞中可能致病，但是更大规模的人群数据还有待进一步探究。 钙通道阻滞剂可靶向用于CACNA1H突变或体细胞CACNA1D突变的APA患者。 也有报道PASNA 患者对于硝苯地平治疗反应良好。

三、Na+-K+ATP 酶α1 亚单位（sodium/potassium ATPase alpha-1, ATP1A1） 和钙离子转运ATP 酶B3（ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 3，ATP2B3）基因

Beuschlein 等[21]报道5.2%APA 患者携带ATP1A1突变，ATP1A1基因编码细胞膜上ATP1A1，由10 个跨膜蛋白组成M1～M10 结构域和细胞内的N 端和C 端。ATP1A1的体细胞突变主要位于M1、M4 及M9 结构域。 M1 和M4 结构域中的突变会影响钾离子结合带，降低离子泵对钾离子的亲和性；M9 结构域中的突变可能会影响钠特异性位点，所有突变都降低离子泵的活性。 对钾离子亲和性降低和离子泵活性的下降在不明显升高细胞内钙离子浓度的情况下导致膜去极化。 利用CYP11B2 免疫组织化学（组化）引导的高通量测序技术发现8%～17%的APA 患者具有ATP1A1突变。

Beuschlein 等[21]报道1.6% APA 患者携带ATP2B3突变，ATP2B3基因编码细胞膜钙泵（Ca2+-ATP 酶，又称PMCA3），由10 个跨膜蛋白组成M1～M10 结构域和细胞内的N 端和C 端。 所有ATP2B3突变均是框内缺失突变， 影响在M4 结构域的PEGL（脯氨酸-谷氨酸-甘氨酸-亮氨酸）位点，该区域参与钙结合以及离子门控。 一些研究发现1.7%～10% APA 中携带有ATP2B3突变， 利用CYP11B2免疫组化引导的高通量测序技术这一比例可进一步提高。ATP2B3突变导致离子泵活性下降，使钙外流受损，增加胞浆内的钙离子浓度，激活钙信号通路。 另外有研究证明，该突变可能通过离子泵的钠离子内流，导致细胞膜去极化，从而使电压门控的钙离子通道开放，或由钙内流直接引起细胞内钙离子浓度增加[22]。

四、氯化物通道2（chloride channel 2, CLCN2）基因

FH-Ⅱ是FH 最常见形式， 其表型具有多样性，既往FH-Ⅱ诊断基于2 个或2 个以上家庭成员受到影响，且无法确定其他的遗传病因[23]。 2018年发表的一项研究中， 在第一个报道FH-Ⅱ家族中发现了编码氯离子通道ClC-2 的CLCN2种系突变[24]。CLCN2编码在肾上腺、肾小球表达的电压门控的氯离子通道，该通道在超极化膜电位下开放，通道开放使肾小球细胞去极化，并诱导醛固酮合成酶的表达。 基因突变可使通道功能增强，在肾小球静息电位下的开放率更高，该研究证明了阴离子通道在肾小球膜电位测定、醛固酮生成和高血压中的作用[25]。 而在多项对APA 行全外显子组测序的研究中， 均未发现体细胞的CLCN2突变。

五、β-连环素（catenin beta-1, CTNNB1）、环磷酸腺苷激活性蛋白激酶α 催化亚基（protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha, PRKACA）和犰狳重复序列蛋白质5 （armadillo-repeat containing 5, ARMC5）基因

CTNNB1基因编码β-连环素，在2.1%～5.1%APA 中可检测到该基因的体细胞突变[26]。CTNNB1突变定位于3 号外显子，在皮质醇分泌腺瘤及肾上腺皮质癌中也曾被发现。 有研究发现女性中该突变更为普遍， 且提示与怀孕期间性腺受体在APA内的异常表达相关[27]，但没有CTNNB1基因突变的APA 组织内同样发现由性腺激素调控醛固酮合成的现象。PRKACA基因催化合成环磷酸腺苷依赖蛋白激酶催化亚基α （cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit α）， 在2 例APA 及1 例醛固酮和皮质醇共分泌的患者中发现有该基因的体细胞突变[28]。 皮质醇腺瘤中也存在PRKACA突变，其在自主醛固酮生成和APA 发展中的作用尚不清楚。在美国非裔原发性醛固酮增多症患者中观察到ARMC5的胚系突变[29]，以及在欧洲的一个原发性醛固酮增多症患者队列中发现有胚系ARMC5突变，但是后者经生物学工具预测，未提示有明确的致病作用[30]。 之前的研究提示ARMC5突变与原发性大结节性肾上腺增生的皮质醇增多症相关。以上3 个基因的体细胞突变在APA 中均较罕见，其与其他肾上腺疾病关系更多。

醛固酮产生细胞簇的研究进展

醛固酮产生细胞簇 （aldosterone-producing cell clusters, APCC） 的概念首先于2010 年被提出和描述[31]。 在此之前，醛固酮合成酶（CYP11B2）的表达及醛固酮的合成被认为只发生在肾上腺球状带细胞内，并主要受血管紧张素Ⅱ及钾离子调控。APCC位于包膜下，主要由外部的球状带样细胞和内部的束状带样细胞组成。 利用CYP11B2 免疫组化指引的二代测序技术分析APCC 的基因突变， 结果在35%的APCC 内发现与APA 相同的肿瘤驱动基因，包括CACNA1D、ATP1A1、ATP2B3， 但是没有发现KCNJ5突变[32]。 近来，有研究描述了从APCC 到APA的转变过渡状态，包括包膜下APCC 样结构和微小APA 样结构组成， 并且带有体细胞突变， 提示APCC 可能是APA 发生的起点[33]。 然而，有其他研究表示APA 的发展有两条独立的路线， 结果显示毗邻APA 的肾上腺皮质可能出现球状带的增生及结节增多，血管生成减少。 相互远离的CYP11B2 阳性结节在同一肾上腺内可能带有不同的体细胞突变， 与APA 相邻的不同APCC 同样可能带有不同的体细胞突变[34]。 在过去10 年中，对于APCC 的发现和探索为理解调控醛固酮生物合成的机制提供了一种新的模式，但其在正常肾上腺中的生理性作用有待进一步研究。APCC 中存在APA 驱动基因的体细胞突变， 表明其可能在APA 及增生型醛固酮增多症的发生、发展过程中发挥作用，APCC 模型支持APA 可能来源于APCC 的观点。

原发性醛固酮增多症的动物模型

以上遗传学研究极有助于理解原发性醛固酮增多症的发病机制，明确了离子通道以及Wnt/β-连环素信号通路的重要作用。虽然小鼠模型并未能完全复制人原发性醛固酮增多症的典型症状，但其在机制的深入研究、药物的筛选研发中有着不可替代的作用。研究同样发现钾通道与Wnt/β-连环素信号通路在调节肾上腺皮质醛固酮合成和稳态中起关键作用。 在小鼠中， TASK1 和TASK3 是钾通道的双孔域蛋白，由KCNK3和KCNK9基因编码合成。通过全身敲除这2 个基因， 研究明确了钾通道在肾上腺皮质结构和功能中的重要作用， 敲除基因小鼠出现不同形式的醛固酮增多症/低肾素性高血压[35-37]。

如前述CACNA1H激活突变在人群中导致FH-Ⅳ， 最新有研究利用规律成簇间隔短回文重复序列 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/CRISPR 相关蛋白9（Cas9）在小鼠中敲入M1560V 突变位点， 并同时研究CACNA1H基因敲除小鼠。结果显示，突变小鼠醛固酮明显升高，CYP11B2表达也明显增加。 敲除小鼠的Ren1表达升高， 但是CYP11B2表达没有改变。以上小鼠实验结果是人群基因测序结果的有力补充，证明了CACNA1H胚系突变足以引起原发性醛固酮增多症， 并且在Cav3.2 丢失后能通过激活肾素-血管紧张素系统进行功能代偿[38]。

前述CLCN2突变是FH-Ⅱ的致病基因，2 种不同的基因敲入小鼠模型提供了有关氯离子通道在原发性醛固酮增多症发展中的作用[39-40]。 敲除在ClC-2 氯离子通道失活区域的N 端8 个残端，而人p.Met22Lys、p.Gly24Asp 和p.Tyr26Asn 突变均在该区域，可以使小鼠同样出现高血压、低血钾症、醛固酮升高和肾素水平降低，重现原发性醛固酮增多症的主要特征。携带p.Arg180Gln 杂合突变的小鼠，与FH-Ⅱ中发现的人p.Arg172Gln 突变相似， 表现为轻度原发性醛固酮增多症， 包括醛固酮水平升高，轻度血压升高，但没有导致肾上腺形态的异常。这些模型是研究FH-Ⅱ自主醛固酮产生机制有价值的工具。 此外，有研究利用人工突变模拟大部分原发性醛固酮增多症相关的人CLCN2突变， 结果有力地支持了以下观点，ClC-2 离子内流增加足以导致原发性醛固酮增多症，而不需其他额外突变相关的机制参与。