内分泌肿瘤分子诊断平台的建立和应用

叶 蕾， 王卫庆

（上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢科 上海市内分泌代谢病研究所国家代谢性疾病临床医学研究中心（上海） 国家卫健委内分泌代谢病重点实验室上海市内分泌肿瘤重点实验室，上海 200025）

分子诊断是指应用分子生物学方法检测个体遗传物质的变异实现对疾病的诊断，是检验医学与临床医学研究与应用的重要专业领域，其广泛应用极大推动了临床医学的发展。内分泌肿瘤是一大类累及内分泌腺体和细胞的肿瘤，患者面临肿瘤与激素分泌双重威胁， 致病基因变异是内分泌肿瘤发生、发展的重要发病机制。 不同基因变异直接决定了肿瘤的生物学行为、治疗反应与长期预后。因此，内分泌肿瘤诊治的关键，过去在于激素分泌的精确评估， 而在分子诊断越来越深入临床实践的今天，则是激素分泌评估联合分子诊断[1]。

内分泌肿瘤致病基因的发现

与其他肿瘤和遗传病一样，分子生物学技术尤其是遗传学技术的进展促成了内分泌肿瘤致病基因的发现。 以多发性内分泌腺瘤病2 型（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2）为例，早在1985 年人们通过转染淋巴瘤DNA 至NIH3T3 细胞， 发现了RET（rearrangement during transfection）基因[1]。但在1993 年之前， 只能通过定位克隆的方法将MEN2 的致病基因定位在10q11.2 约480 kb 的范围，1993 年由来自英国剑桥大学的Ponder 教授团队通过PCR 联合化学切割错配 （chemical cleavage of mismatch, CCM）的方法成功确认RET点突变导致MEN2[2]。 类似的方法促成了一系列重要内分泌肿瘤致病基因的发现， 比如1997 年发现胚系MEN1基因失活变异导致MEN1，以及GNAS、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphae，cAMP）依赖性蛋白激酶调节亚基1α （cAMP-dependent protein kinase regulatory type Ⅰ-alpha，PRKAR1A）、VHL（von Hippel-Lindau）、 神经纤维瘤病1 型（neurofibromatosis type1,NF1） 与琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH） 等基因突变是内分泌肿瘤的重要病因。 十余年前由于高通量测序技术的发展，迎来了第2 次内分泌肿瘤致病基因发现高峰，比如肾上腺库欣腺瘤的致病基因PRKACA、 原发性醛固酮增多症的致病基因内向整流型钾离子通道亚家族J 成员5 （potassium inwardly-rectifying channel,subfamily J, member 5，KCNJ5）、胰岛素瘤的致病基因转录因子（Yin Yang 1，YY1），以及肾上腺双侧大结节样增生的致病基因犰狳重复序列5（armadillo repeat containing 5,ARMC5）等[3]。 目前大多数内分泌肿瘤的致病基因已经明确，这使得临床的病因诊断成为可能。

分子诊断的临床意义

检测上述内分泌肿瘤发生、发展的关键致病基因，不仅可以协助疾病早诊断、早治疗，还可以指导疾病分层与预后管理，以及作为伴随诊断指导药物治疗。 例如胚系RET原癌基因突变是遗传性甲状腺髓样癌（medullary thyroid cancer, MTC）的分子基础，RET胚系致病突变患者MTC 的外显率几乎为100%。 同时，RET基因型与MTC 危险等级之间存在较强的基因型-表型相关关系， 不同危险等级的患者MTC 的发病年龄、肿瘤分期、复发与长期生存率具有明显差异。 胚系RET原癌基因突变检测有助于遗传性MTC 及MEN2 的诊断，MTC 危险等级的判定，术前临床肿瘤范围的全面评估，并指导临床医师决定手术次序； 家系成员RET基因胚系突变筛查，可实现MTC 的早期诊疗[4]。其中，对于家系中RET基因突变阳性者， 应定期随访以早期发现并诊治，同时可考虑预防性甲状腺切除术；对于有生育需求者， 胚胎植入前遗传学诊断/筛查使得育龄期患者能够避免RET突变在家系中的传递[4]。 而针对于RET的靶向治疗， 包括近年研发的选择性RET抑制剂如塞普替尼（selpercatinib）和普拉替尼（pralsetinib）， 有望为晚期进展性MTC 提供有效的治疗机会[5]。

目前， 多个国内外权威指南推荐进行内分泌肿瘤相关致病基因检测，比如2014 年嗜铬细胞瘤诊治指南（美国内分泌学会）推荐所有嗜铬细胞瘤患者应该考虑进行基因检测，可用临床特征驱动的诊断流程决定优先选择特定的基因检测，副神经节瘤患者进行SDH突变检测，转移患者进行SDHB基因突变检测[6]；《中国抗癌协会神经内分泌肿瘤诊治指南（2022 年版）》推荐检测遗传肿瘤综合征的致病基因以协助此类疾病的诊断[7]；《甲状腺髓样癌诊断与治疗中国专家共识（2020 版）》推荐MTC 患者等5 类人群进行RET基因筛查和遗传咨询[8]。

实验室要求

临床分子检测应遵循《医疗机构临床基因扩增实验室》等要求完成。 分子检测实验特别是高通量测序的操作步骤多、程序复杂，湿实验包括样本处理（取材与运输和核酸提取），文库构建、靶向序列富集与测序等； 干实验包括测序后数据质量分析、比对、变异识别、注释和结果报告与解释等生物信息学分析流程。 分子检测实验室各功能区需有严格有序的物理分隔及持续的通风换气，以避免核酸气溶胶引起的交叉污染，还需注意各功能区物品专用、各功能区域的单一工作流向等；分子检测各环节必须制定可操作性的标准操作程序并严格遵循，进行严格的质量控制，包括核酸质量、测序结果的覆盖深度、均一性、在靶率等。临床分子检测还应根据临床预期用途，进行性能确认，包括准确性、精密度、检测限等。 肿瘤变异的报告及解释应遵循标准指南， 如美国医学遗传学和基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）2015 年遗传性变异解读指南， 判读该变异为致病性变异、可能致病性变异、临床意义未明、可能良性与良性变异[9]；以及2017 年体细胞变异解读指南（2017 版），从临床诊断、预后、治疗等方面进行评估，将变异分为强临床意义、潜在临床意义、临床意义不明、良性4 类[10]。

与内分泌肿瘤发生相关的基因种类繁多，且遗传性内分泌肿瘤临床症状常表现为综合征的形式，各种遗传性内分泌肿瘤综合征的症状互有重叠。因此对单基因突变的检查不能很好地满足对内分泌肿瘤的高效率基因诊断。目前针对内分泌肿瘤尚无靶向测序panel，且已有的广谱肿瘤诊断panel 不能很好地覆盖内分泌肿瘤的高频率突变基因。为了更有效地服务于内分泌肿瘤的临床诊治，上海交通大学医学院附属瑞金医院（瑞金医院）内分泌代谢科自建神经内分泌肿瘤基因突变检测方法[11]，可以明确38.1%神经内分泌肿瘤患者分子分型。 基因检测适用于内分泌肿瘤的诊断和分子分型，适用样本包括外周血样本、新鲜组织样本，亦适用于靶向药治疗方案选择指导。

瑞金医院内分泌肿瘤特色

瑞金医院内分泌代谢科于20 世纪50 年代成功诊治国内第1 例原发性醛固酮增多症，2003 年报道了国内第1 例基因诊断明确的MEN2[12]。 以此为基础，逐步建立基因检测平台，协助内分泌肿瘤的临床诊疗，2007 年成功建立科学完备的程式化基因诊断平台。 2008 年“单基因遗传性内分泌疾病的基础研究和临床应用”获得国家科技进步奖二等奖。 2010 年后利用高通量测序技术，发现多种致病新基因与分子标志物，包括发现65.5%肾上腺库欣腺瘤存在PRKACAL205R热点突变， 突变型肿瘤体积小、分泌能力强、StAR表达强阳性[13]；报道30%胰岛细胞瘤存在YY1T372R位点突变， 突变型起病年龄大[14]；发现24.3%甲状腺腺瘤样结节存在SPOPP94R/EZH1Q571R/ZNF148特异基因变异， 为良性结节分子标志物[15]；循证证实人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2） 表达可预测嗜铬细胞瘤转移，预测率达77%[16]。 2017 年“内分泌肿瘤发病机制新发现与临床诊治技术的建立和应用”获得国家科技进步奖二等奖。目前已建立国际单中心最大的多个基因型明确的疾病队列，如多发性内分泌腺瘤病，嗜铬细胞瘤，原发性醛固酮增多症、原发性双侧大结节样肾上腺增生症，先天性肾上腺皮质增生症等。 提出疾病预后与治疗反应的基因型特征，如KCNJ5突变型腺瘤型原发性醛固酮增多症手术效果好[17]。 目前分子诊断平台通过内分泌疑难病例报告系统向全国通道开放，可通过上海市内分泌代谢病研究所微信公众号“疑难病例”模块注册登录，已向全国30 余家单位提供相关基因检测服务。