非对称性二甲基精氨酸在不明原因复发性流产患者绒毛及外周血的表达及其意义

曾瑜 边亚芹 杨怡春 彭冬先

(1.南方医科大学珠江医院,广东 广州 510280;2.南方医科大学第二临床医学院,广东 广州 510280;3.深圳市龙岗中心医院,广东 深圳 518100)

复发性流产是一种患者连续发生≥3次,20周前妊娠产物丢失的病理性妊娠状态,与感染、遗传及内分泌等因素有关[1-2]。目前仍有约50%复发性流产患者尚未发现原因,称为原因不明复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA),导致患者再次妊娠失败的风险增加[3]。研究表明,绒毛血管增生、滋养细胞增殖对正常妊娠至关重要,在孕早期,绒毛外滋养细胞进入中螺旋动脉,增加胎盘血供,维持妊娠需求[4-5]。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是调节血流灌注的重要因子,在促进胚胎存活方面发挥重要作用[6]。非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)由蛋白质氨基酸侧链经甲基化修饰水解后形成,是一种内源性NO合成酶抑制剂,ADMA可通过减少NO的产生损害内皮细胞功能,从而对胎儿发育造成不良影响[7-8]。然而目前关于ADMA与URSA的相关性尚不明确,因此,本研究以URS患者为研究对象,旨在探讨ADMA在URSA患者血浆及绒毛组织中的表达其临床意义,以期为临床治疗提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月-2021年12月南方医科大学珠江医院收治的URSA患者168例为研究对象,采用计算机产生随机数法将就诊患者以3∶1的比例分为训练集126例(URSA组)和测试集42例,分别用于构建风险预测模型和验证模型预测效能。另选取同期于我院进行终止妊娠的126例孕妇作为对照组。纳入标准：①自然流产次数≥3次,经诊断确诊为URSA。②B超检查结果证实胚胎停止发育、无原始胎心搏动。③无家族遗传病史,夫妇双方染色体核型检查结果正常。④妇科检查、超声及子宫输卵管造影检查排除患者生殖器官畸形。⑤患者性激素、甲状腺功能、内分泌功能正常。⑥无生殖道感染。⑦临床资料完整,无精神障碍。排除标准：①流产原因明确,即因感染、染色体异常、解剖结构异常及自身免疫疾病等因素导致的流产。②生殖内分泌激素异常患者。③患者合并甲状腺疾病、糖尿病及自身免疫疾病。④合并恶性肿瘤。⑤近三个月服用过激素类药物。对照组纳入标准：①无不良妊娠史。②产前检查结果提示胎儿发育正常,血绒毛膜促性腺激素检查正常。

1.2 研究方法 通过查阅电子病历收集患者年龄、孕周孕酮水平等一般资料,入院后采集5 mL空腹静脉血,低温分离血浆,置-80 ℃冷冻保存。分别采集两组女性人工流产术后的新鲜绒毛,生理盐水常规冲洗,匀浆后取上清液待测,采用酶联免疫吸附法检测血清及绒毛组织上清液ADMA水平。Th17、Treg细胞采用美国Thrmo Fisher公司生产的流式细胞仪检测。白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-17、转化生长因子-β(TGF-β)采用ELISA试剂盒检测。收集的胎盘标本冰冻切片,HE染色后由同一病理科医师阅片。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,计数资料采用2检验,计量资料采用t检验,以表示,通过阈值效应分析孕妇与血浆及绒毛ADMA与URSA发生风险的关系,采用多因素Logistics回归模型分析发生URSA的独立危险因素,采用R软件构建列线图预测模型。检验水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 训练集患者年龄20～37岁,平均(27.52±2.94)岁,孕周6～12周,平均孕周(9.22±1.89)周。测试集患者年龄22～36岁,平均(27.84±2.67)岁,孕周6～11周,平均孕周(8.89±1.74)周,训练集和测试集患者一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组孕妇年龄23～36岁,平均(28.01±2.88)岁,孕周6～10周,平均孕周(8.56±1.68)周。与对照组比较,URSA组患者IL-6、IL-17、Th17及Th17/Treg显著增加,孕酮、IL-10、TGF-β及Treg显著降低(P<0.05),见表1。

表1 两组患者临床资料比较

2.2 两组患者外周血和绒毛组织ADMA表达 与对照组比较,URSA组血浆及绒毛组织ADMA表达均显著增加(P<0.05),见表2。

表2 两组患者外周血和绒毛组织ADMA表达

2.3 两组胎盘病理形态学改变 对照组绒毛发育良好,而胎盘光学显微镜下可见不同程度的绒毛发育不良,合体结节增多,并伴有微血栓形成,见图1。

图1 两组胎盘病理形态学改变

2.4 URSA发生的多因素分析 以表1中差异具有统计学意义的指标及血浆、绒毛组织ADMA表达为自变量,以是否发生URSA为因变量,进行多因素分析,结果显示IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg及血浆ADMA、绒毛组织ADMA是发生URSA的独立危险因素,而孕酮、IL-10、TGF-β及Treg是发生URSA的保护因素,见表3。

表3 多因素Logistic回归分析URSA发生的相关因素

2.5 血浆及绒毛ADMA与URSA的平滑曲线拟合 采用平滑曲线拟合血清血浆及绒毛ADMA与URSA的相关关系。在调整年龄、孕周等混杂因素后,采用广义相加模型和曲线拟合分析血浆及绒毛ADMA与URSA的关系,结果显示,血浆及绒毛ADMA与URSA呈线性正相关关系,随着二者水平的升高,孕妇发生URSA的风险增加,见图2。

图2 血浆及绒毛ADMA与URSA的平滑曲线拟合图

2.6 血浆及绒毛ADMA与URSA的阈值效应分析 调整受试者年龄、孕周等混杂因素后,当血浆ADMA≥1.43 μmol/L时,血浆ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加17%,差异具有统计学意义(OR=0.115,95%CI：0.102～0.133,P<0.05);当血浆ADMA<1.43 μmol/L时,差异无统计学意义(OR=1.080,95%CI：0.912～1.215,P>0.05)。当绒毛ADMA≥1.92 μmol/L时,绒毛ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加14%,差异具有统计学意义(OR=1.192,95%CI：1.085～1.302,P<0.05);当绒毛ADMA<1.92 μmol/L时,差异无统计学意义(OR=1.069,95%CI：0.926～1.118,P>0.05)。

2.7 模型构建 采用“rms”程序包,根据筛选出的9个独立影响因素建立预测孕妇发生URSA的列线图预测模型。结果显示,IL-6>190.45 nmol/L为35分,IL-17>916.25 nmol/L为15分,Treg<4.89%为30分,血浆ADMA>1.43 μmol/L为40分,IL-10<640.10 nmol/L为31分,TGF-β<2024.15 nmol/L为22.5分,Th17>2.62%为25分,绒毛ADMA>1.92 μmol/L为42.50分,Th17/Treg>0.56为20分,9项独立影响因素总分为 261分,对应孕妇发生URSA的风险值为0.890,即模型预测孕妇发生URSA的概率为89.00%,见图3。

图3 预测孕妇发生URSA的列线图预测模型

2.8 模型评价

2.8.1 ROC曲线评价模型区分度 采用ROC曲线对模型区分度进行评价,训练集AUC为0.758(95%CI：0.682～0.834,P<0.001);C-index为0.882。测试集AUC为0.732(95%CI：0.682～0.782,P<0.001);C-index为0.878。预测模型在训练集和测试集中的C-index均>0.75,模型区分度较高。见图4。

图4 预测模型在训练集和测试集中的ROC曲线

2.8.2 列线图模型校准度 评价绘制预测模型的校准曲线,结果显示模型的预测概率曲线与参考概率拟合度良好,Hosmer-Lemeshow检验结果差异无统计学意义(P>0.05),提示该模型准确度较高,见图5。

图5 预测模型在训练集和测试集中的校准曲线

2.8.3 列线图模型有效性评价 绘制临床决策曲线,结果显示,在训练集和测试集中模型均远离极端曲线,净获益高,提示构建的列线图模型安全可靠,实用性强。见图6。

图6 预测模型在训练集和测试集中的临床决策曲线分析

3 讨论

复发性流产是临床常见的妇科疾病,发生率约为1%～5%[9],随着妇女流产次数的增多,出现复发性流产的风险也逐渐增加。其病因复杂,目前的研究认为感染、遗传、及内分泌失调等均可能导致复发性流产[10-12],但仍有部分患者病因不明。研究表明,在妊娠早期胚胎生长环境相对缺氧,氧分压变化可影响绒毛血管生成,对胚胎的生长发育产生影响[13]。ADMA是L-精胺酸类似物,由Ⅰ型和Ⅱ型蛋白质精氨酸甲基转移酶催化后水解而来,最终通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylamine hydrolase,DDAH)代谢为L-瓜氨酸和二甲胺[14-15]。ADMA在细胞和组织中广泛存在,是一氧化氮合酶的抑制剂,通过抑制NO的合成参与血管内皮细胞功能障碍的生理和病理过程[16]。

健康孕妇孕早期血浆ADMA有所下降,随着妊娠时间的延长,血浆ADMA增加,而在孕晚期又降低至非孕期水平,究其机制,ADMA在孕早期水平降低可促进子宫螺旋动脉收缩,从而增强滋养细胞的迁移能力,增加胎盘血供,促进胎儿正常生长发育[17];而在孕晚期,ADMA水平增加,NO水平降低,从而提高子宫收缩功能,促进产妇分娩[18]。此外,NO也在维持胎儿宫内发育中发挥重要作用,可通过增加环鸟苷酸水平促进血管舒张,维持细胞及血浆转运系统稳定[19-20]。本研究显示,URSA患者URSA组血浆及绒毛组织ADMA表达均显著增加,通过选择性结合NOS抑制NO的形成,导致血管完整性受到破坏、胎盘血流灌注不良,蛋白质合成和细胞增殖受到抑制[21]。且本研究通过拟合曲线及阈值效应分析发现,血浆及绒毛ADMA与URSA呈线性正相关关系,随着二者水平的升高,孕妇发生URSA的风险增加,当血浆ADMA≥1.43 μmol/L时,血浆ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加17%,;当绒毛ADMA≥1.92 μmol/L时,绒毛ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加14%。

本研究发现,IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg及血浆ADMA、绒毛组织ADMA是发生URSA的独立危险因素,而IL-10、TGF-β及Treg是发生URSA的保护因素。研究表明,URSA患者外周血CD4+T淋巴细胞数量较健康孕妇明显增加,而Th17、Treg均属CD4+T亚群,其中Th17可可通过分泌IL-6、IL-17等炎性因子调节免疫功能,导致母儿发生免疫排斥反应,导致流产[22-23]。而Treg细胞则主要分泌IL-10、TGF-β等抑制性炎性细胞因子,可间接提高母体免疫耐受程度,促进胎儿生存[24]。在正常的生理状态下,Th17和Treg处于动态平衡,共同维持人体的免疫功能,而在URSA患者中,IL-6、IL-117、Th17及Th17/Treg较对照组显著增加,孕酮、IL-10、TGF-β及Treg较对照组显著降低,母体免疫反应呈现“Th17趋向”,增强母儿免疫排斥反应[25]。基于多因素回归分析结果,本研究构建了风险预测模型,通过对各独立影响因素进行量化评分,从而评估孕妇发生URSA的风险,ROC曲线、校准曲线及临床决策曲线评价结果显示该预测模型区分度、准确性较高,临床有效性较好,可为临床准确预URSA的发生提供指导。

本研究纳入的样本量较少且数据来自单一中心,增加了选择偏倚的风险,后续研究需扩大样本量进行多中心研究,以评估预测模型在不同环境及地域人群中的适用性。

4 结论

ADMA在URSA患者血浆及绒毛组织中的表达增加,是URSA发生的独立危险因素,对URSA的发生具有一定的预测价值。