清热生肌膏介导NLRP3对放射性皮炎大鼠MPO、Hyp表达的影响*

杨文博 孙云川 杨洪娟 杜强 徐旭英

(1.河北省沧州中西医结合医院,河北 沧州 061000;2.首都医科大学附属北京中医院,北京 100000)

放疗是肿瘤的主要治疗方法,虽然其对肿瘤的治疗效果显著,但放射线在治疗的同时还会损伤正常组织,引发放射性皮炎[1]。中医认为,放射线为火热毒邪,在对放射性皮炎的治疗中应以清热解毒为主,从而达到治疗创伤皮肤的目的[2]。中医对该病采用清热解毒、益气理脾等原则进行治疗[3],清热生肌膏具有清热解毒、活血化瘀等作用,该药已被证实对于治疗烫伤具有显著作用[4]。炎性反应是机体在受到刺激后的保护性免疫反应,炎性反应能力降低会导致机体受到感染,过高则会增加机体的炎症,最终引发炎症性疾病产生。冰原会激活炎性小体,而关于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)的研究是炎性小体中研究最为深入的。NLRP3参与多种炎症疾病的始末,如肿瘤、炎症性肠病等。研究证实NLRP3及其下游因子在多发性肌炎和皮肌炎中发挥重要作用,并与辅助性T细胞亚群联系密切,一定程度上可诱导这些疾病的发展[5]。髓过氧化酶(Myeloperoxidase,MPO)可反应中性粒细胞的数目与活性,是评价炎症程度的指标。羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)主要定位于皮肤、结缔组织,可反映胶原蛋白的含量,其水平高低可反映胶原的合成能力,在皮肤愈合的过程中,可反应创面修复程度。目前MPO、Hyp在烫伤中的作用已有研究证实[6-7],但关于两者在放射性皮炎中的文献较少,具体作用尚未完全掌握。因此文本研究清热生肌膏介导NLRP3炎性小体对放射性皮炎大鼠皮肤损伤修复及MPO、Hyp表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SD健康大鼠90只,由长沙市天勤公司提供[生产许可证号：SCXK(湘)-2019-0025],体质量在200～300 g之间,鼠龄在6～8周,常规饲养,自由饮食饮水。本研究经医院动物伦理委员会批准(批号：20190203)。

1.2 主要实验试剂与仪器 清热生肌膏(汕头市美宝制药有限公司,批号1312403A),二甲基苯蒽(上海西格玛奥德里奇贸易有限公司,货号：D3254-100MG),复方茶多酚软膏(大连市皮肤病医院药剂科研制),透射电镜(苏州沃弗本精密机械公司,型号：蔡司Xradia Context microCT);苏木素-伊红(厦门海菲生物公司);裂解液(北京普利莱基因技术公司);匀浆机(上海坤诚科学仪器公司);MPO、Hyp试剂盒(合肥莱尔生物公司);NLRP3、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-1)一抗(深圳豪地华拓生物公司)、山羊抗兔二抗(北京全式生物公司)。

1.3 药物 清热生肌膏组成：金银花20 g,连翘20 g,蒲公英20 g,生黄芪20 g,玄参20 g,当归15 g,冰片10 g。

1.4 乳腺癌模型建立及放射性皮炎模型建立 参照文献[8]建立放射性皮炎模型,将大鼠固定后,暴露左下肢,其余部位遮蔽,采用军事医学科学院60Co源照射,30 Gy γ 射线一次照射,照射剂量率0.68 Gy/min,照射距离2 m,照射时间12 min 2 s。按国际抗癌联盟急性放射反应评分标准[9],30只大鼠造模成功。

1.5 分组及干预 取80只大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组、对照组,每组20只。除正常组外均建立放射性皮炎大鼠模型。正常组与模型组大鼠常规饲养;治疗组：大鼠于伤口处均匀涂抹清热生肌膏,2次/d;对照组：大鼠于伤口处均匀涂抹复方茶多酚软膏,2次/d。各给药组均持续给药3周[10]。剩余10只大鼠另设抑制剂组：取10只大鼠建立放射性皮炎模型,建模成功24 h后于尾静脉注射NLRP3抑制剂(MCC950,10 mg·kg-1),用以蛋白印迹实验。辐射伤后1、3、7、14、21 d[10]各组分别处死两只大鼠,剩余大鼠于治疗结束后立即处死用于后续实验。

1.6 检测指标

1.6.1 创面愈合测定 辐射伤后1、3、7、14、21 d各组分别处死两只大鼠。将创面描记在纸上,后用图像分析仪测定面积。创面愈合率=(开始照射面面积-未愈合创面面积)/开始照射面面积。

1.6.2 透射电镜观察创面组织细胞超微结构 取各组大鼠创面组织(正常组大鼠取正常皮肤组织)切成小块后放入戊二醛中固定2 h,PBS清洗后固定0.5 h,PBS清洗,梯度脱水,包埋,制成50 nm超薄结构组织,后用投射电镜观察。

1.6.3 苏木素-伊红( Hematoxylin,HE)染色观察大鼠创面皮肤组织病理改变 取各组大鼠创面组织(正常组大鼠取正常皮肤组织),石蜡切片,脱蜡、水化,苏木素浸染 10 min,伊红复染 5 min,脱水、透明、封片后于光学显微镜下观察拍照,并通过网形目镜计数炎性细胞数量。

1.6.4 分光光度比色法测定MPO活性 取各组大鼠创面组织(正常组大鼠取正常皮肤组织),裂解液裂解后匀浆机匀浆,在4 ℃、6000 r/min的条件下离心15 min,取上清液,离心15 min,取上清,在460 nm处测定OD值,MPO活性=(测定管OD值-对照管OD值)/11.3×取样量。

1.6.5 样本碱水解法检测Hyp含量 Hyp在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈紫色,根据其呈色的深浅可推算其含量。称量各组大鼠创面组织(正常组大鼠取正常皮肤组织)放人试管中,加入水解液,混匀,加盖后95 ℃或者沸水浴水解20min。调pH值至6.0～6.8,加入双蒸水,混匀,加入适量活性炭,混匀。60 ℃水浴15 min,冷却后3500 r/min离心10 min,取上清在波长550 nln处测定各管吸光度值。

1.6.6 免疫印迹检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达 取各组大鼠创面组织(正常组大鼠取正常皮肤组织),剪碎,裂解液裂解,匀浆机匀浆,在4 ℃下离心5 min, 12000 r/min,取上清置于-20 ℃保存;根据试剂盒说明对蛋白定量。各组蛋白电泳上样量30 μg,分离蛋白样本,转至PVDF膜,封闭后加NLRP3、Caspase-1一抗孵育过夜(1∶500),次日加入1∶10 000稀释的山羊抗兔二抗,室温孵育2 h,PBS清洗10 min 4次,Odyssey V3.0软件分析,以各目的蛋白条带与GAPDH条带的灰度比值作为相对表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠创面愈合比较 各组大鼠在治疗后第1 d时的创面愈合比较差异无统计学意义(P>0.05),模型组大鼠在治疗3-21 d时的创面愈合均低于治疗组及对照组(P<0.05)。治疗组与对照组大鼠治疗3～21 d时创面愈合比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 创面愈合

2.2 各组大鼠创面组织细胞超微结构 正常组大鼠皮肤组织细胞线粒体呈圆形,结构清晰。模型组线粒体肿胀,呈凋亡细胞改变。与模型组相比,治疗组与对照组有所改善,见图1。

图1 各组大鼠创面组织细胞超微结构(10000×)

2.3 各组大鼠皮肤病理形态 正常组大鼠真表皮层完整,细胞排列整齐,无坏死,模型组大鼠创面组织可见大量炎性细胞浸润,表皮层坏死,结构紊乱; 与模型组相比,治疗组与对照组明显改善。见图2。

图2 HE染色观察各组大鼠病理组织形态(100×)

2.4 各组大鼠皮肤创面组织中MPO、Hyp表达比较 与正常组相比,模型组大鼠皮肤创面组织中MPO表达升高、Hyp表达降低(P<0.05)。与模型组相比,治疗组模型组大鼠皮肤创面组织中MPO表达降低、Hyp表达升高(P<0.05)。治疗组与对照组各指标对比无差异(P>0.05),见表2。

表2 各组大鼠 MPO、Hyp表达比较

2.5 各组大鼠皮肤创面组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达 与正常组相比,模型组NLRP3、Caspase-1蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组相比,治疗组大鼠皮肤创面组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达降低(P<0.05)。治疗组与抑制剂组大鼠皮肤创面组织中NLRP3、Caspase-1蛋白对比无差异(P>0.05)。见表3、图3。

图3 各组NLRP3、Caspase-1蛋白表达对比

表3 NLRP3、Caspase-1蛋白表达

3 讨论

NLRs是机体免疫细胞的主要模式识别受体(Patho- gen recognition receptor,PRRs)之一。损伤相关分子激活NLRs后,通过炎性反应维持免疫耐受等。在NLRs家族中,NLRP3的研究较为深入。NLRP3由胞浆内多种蛋白组成,含有凋亡相关微粒蛋白等[11]。Caspase-1在炎性反应中发挥着重要作用,同时还具有介导细胞焦亡的作用。NLRP3炎症小体是由其受体蛋白及Caspase-1等组成。NLRP3在被激活后可通过ASC与Caspase-1连接,组成NLRP3炎症小体,激活Caspase-1增加炎性因子并分泌到胞外,从而参与炎症反应[12]。有研究表明,NLRP3/Caspase-1通路在皮肌炎中发挥促炎症作用,基于此本实验认为抑制NLRP3表达可降低放射性皮炎的炎症反应,促进创面愈合的作用[13]。清热生肌膏中金银花、连翘、蒲公英、玄参具有清热解毒、疏散风热、消肿散结的功效;生黄芪、冰片具有清热解毒、抗菌生肌的功效;当归补血活血,调经止痛的功效。本研究运用NLRP3抑制剂作为对照组,证实清热生肌膏具有抑制NLRP3表达,减少炎症的作用。实验结果显示,NLRP3、Caspase-1在模型组中的表达显著高于健康组,在经过清热生肌膏的干预后,NLRP3、Caspase-1水平显著下降,且与NLRP3抑制剂组较为接近。NLRP3抑制剂可有效抑制NLRP3及Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达[14],提示清热生肌膏也可抑制NLRP3的表达,从而降低炎症反应。目前已有研究证实复方茶多酚软膏对与放射性皮炎具有一定的治疗效果,因此文实验运用该药多为药物对照,进一步证实清热生肌膏具有促进创面愈合的作用[15]。实验结果显示,给药第3、7、14、21 d时,治疗组大鼠皮肤愈合率均显著高于模型组且与对照组无差异,提示清热生肌膏具有促进创面愈合的作用。皮肤组织中细胞的生成及结构变化可反应愈合情况,投射电镜可有效观察细胞的变化。本实验HE染色结果证实了给予清热生肌膏后可有效改善创面皮肤组织病理损伤情况。经电镜观察发现,模型组细胞核染色质浓聚,线粒体肿胀,呈凋亡细胞改变;与模型组相比,治疗组与对照组有所改善。提示清热生肌膏能够改善放射性皮炎大鼠病理形态,减少炎性细胞浸润以及皮肤组织细胞凋亡。因此,本研究推测,清热生肌膏可能是通过抑制NLRP3水平,抑制炎症反应,改善病变组织病理形态,促进创面愈合。

MPO具有有效的促氧化和炎症的性质,是评价炎症严重程度的指标之一,其水平的高低可有效监测炎性反应情况,对于本病的治理具有重要作用[16-18]。研究显示[19],MPO在特应性皮炎中为高表达,抑制其表达后,可抑制中性粒细胞浸润,减轻Hyp是胶原蛋白所特有的氨基酸,约占其氨基酸总量的13%,Hyp的含量反映胶原在创面中的含量,从而评估创面愈合情况。目前已有研究显示[20],Hyp在细菌感染皮炎中为低表达,提高其表达后,可促进胶原合成,促进创面愈合。本实验结果显示,与健康大鼠相比,模型大鼠体内MPO升高、Hyp降低,在经过清热生肌膏干预后,MPO降低,Hyp升高。研究显示,在不稳定型心绞痛患者体内,MPO及oxHDL可能通过调节NLRP3的表达,促使THP-1单核细胞产生IL-1β[21]。本文研究推测,清热生肌膏通过抑制NLRP3水平,促进Hyp水平、抑制MPO表达,减少炎症产生,促进胶原合成,较快创面愈合。

4 结论

清热生肌膏可抑制MPO水平并促进Hyp表达,对放射性皮炎大鼠皮肤损伤修复有积极促进作用,其作用机制可能与介导NLRP3炎性小体有关。