液相色谱- 串联质谱法测定豆芽中6 - 苄基腺嘌呤残留量的不确定度

常 薇，邹 力

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710000）

豆芽是各种谷类、豆类、树类的种子培育出可以食用的“芽菜”，也称“活体蔬菜”；品种丰富、营养全面，深受广大消费者的喜爱，因豆芽适合作坊及工厂化生产，近年来各地频繁出现了黑作坊“毒豆芽”事件，即在小作坊生产过程中非法添加6 -苄基腺嘌呤（6-BA），俗称“无根素”。6 - 苄基腺嘌呤是无根素的主要成分之一，是人工合成的一种细胞分裂素，能使豆芽细胞快速分裂的植物激素类成分，通过刺激细胞分裂引起植物生长和发育，抑制呼吸激酶，在豆芽的生长过程中使用可促进芽的生长，抑制根的形成，使豆芽芽体粗大且白嫩无根[1]，并且能起到杀菌作用，从而延长绿色蔬菜的保鲜。人体过量摄入6 - 苄基腺嘌呤，会刺激皮肤黏膜，损伤食道和胃黏膜，引起恶心、呕吐等症状[2]，对眼睛和呼吸道也有一定的刺激伤害性。2011 年，国家标准GB 2760—2011 将6 - 苄基腺嘌呤从豆芽允许使用的食品添加剂名单中剔除。《国家食品药品监督管理总局 农业部 国家卫生和计划生育委员会关于豆芽生产过程中禁止使用6 - 苄基腺嘌呤等物质的公告（2015 年第11 号）》等标准及产品明示标准和指标的要求也明确规定了豆芽生产过程中禁止添加6 - 苄基腺嘌呤等物质[3]。不法商贩及没有相关知识的小作坊，为了降低豆芽生长周期、提高产率，仍旧会在豆芽的培育过程中添加6 - 苄基腺嘌呤，从近些年来抽检食用农产品中豆芽的不合格率可以看出，对豆芽中6 - 苄基腺嘌呤残留量的检测和监管十分重要。

目前，检测6-BA 的方法有液相色谱- 串联质谱法和高效液相色谱法，采用高效液相色谱- 串联质法检测豆芽中6-BA 的残留量，并依据《化学分析中不确定度的评估指南》[4]《测量不确定度评定与表示》 JJF 1059.1—2012[5]的相关规定对该方法的不确定度进行评定，进行不确定度的计算和分析，找出引入不确定度的主要因素，从而完善检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

赛默飞TSQ TCC-3000RS 型号液相色谱- 质谱联用仪，美国Thermo 公司产品；电喷雾离子源（ESI）、H2100R 型高速离心机、Proseers 型纯水机、miniRotar500s 型旋转蒸发仪；XPR205/A 型梅特勒-托利多电子天平，BSA224S 型塞多利斯电子天平。

6 - 苄基腺嘌呤（6-BA） 标准品，TMstandard公司提供；色谱纯乙腈、色谱纯甲醇、色谱纯甲酸，Thermo scientific GOLD HILIC C18150 μm×3.0 μm×3 μm 色谱柱。

1.2 标准溶液的配置

称取标品1 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为10 μg/mL 的储备溶液。根据试验将储备液稀释成1 μg/mL，再用空白基质提取液逐级稀释至10，30，50，100，200 ng/mL标准使用溶液。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备方法

准确称取捣碎的试样5.00 g 于50 mL 聚丙烯离心管中，加入乙腈20 mL，于旋涡混合器上涡旋2 min，加入甲酸0.4 mL，再涡旋2 min，以转速4 000 r/min离心5 min，上清液转移至100 mL 梨形瓶中，于40 ℃条件下旋转蒸发至约2.5 mL，转移至刻度试管中，用甲醇定容至5 mL，过0.22 μm 有机滤膜，供液相色谱- 串联质谱仪分析[6]。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：Thermo scientific GOLD HILIC C18色谱柱（150 μm×3.0 μm×3 um）；柱温40 ℃；进样量2 μL，流速0.3 μL/min，进样量2 μL，流动相：A相为乙腈；B 相为0.1%甲酸水；流速0.3 mL/min，梯度洗脱0～2 min，75%B；2～4 min，25%B；4～5 min，25%B；5.0～5.1 min，75%B；5.1～6.0 min，75%B。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），负离子模式；质谱扫描方式：多反应监测模式（MRM）；离子源温度325 ℃，离子源电压3 500 V，鞘气SHeath Gas(Arb)：40；Aux Gas(Arb)：10；Sweep Gas(Arb)：1；定量离子对为（m/z） 224.08＞133.07 碰撞能量22.4 V；定性离子对为（m/z） 224.08＞106 碰撞能量33.9 V。仪器工作软件为Trace Finder。

1.3.4 数学模型

样品中6-BA 残留量的计算公式为：

式中：X——样品中6-BA 的残留量，mg/kg；

C——目标物标准工作溶液的质量浓度，mg/L；

A——试样测定液中目标物定量离子的峰面积；

AS——标准工作溶液中目标物定量离子的峰面积；

V——试样溶液定容体积，mL；

m——试样溶液所代表试样的量，g；

f——待测组分的回收率，%；

R——稀释倍数（R=1）。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度的来源

根据数学模型并结合试验方法分析，影响豆芽中6 - 苄基腺嘌呤残留量的不确定度主要有以下几个方面。

2.1.1 前处理样品称量引入的不确定度Urel(m)

2.1.3 配制6- BA 标准溶液过程中引入的不确定度

（1） 标准物质纯度引入的不确定度Urel(p)。此次标准物质使用的是TMS 坛墨质检标准物质中心生产的编号为21110304 的甲醇中6-BA。根据标物证书可知6-BA 的不确定度为3%。

（2） 储备液配制过程中引入的不确定度Urel(W1)。

（3） 标准曲线配制引入的不确定度Urel(W2)。标准工作液由豆芽空白基质提取液稀释储备液配制而成。分别用量程为10 μL 和100 μL 的移液枪精密量取储备液（质量浓度1 μg/mL） 10，30，40，50，100，200 μL，用空白基质提取液定容至1.0 mL，作为基质混合标准工作溶液S0、S1-S5。质量浓度依次为0，10，30，50，100，200 ng/mL。

2.1.4 根据拟合标准曲线求得样品质量浓度引入的不确定度U(Y)

将6-BA 5 个质量浓度的标准工作溶液，每个质量浓度测定3 次，得到相应的峰面积（见表1）。采用最小二乘法拟合，得到标准线性回归方程Y=1.118×104X-1 747，R=0.998 3。将被测样品平行测3 次，所得峰面积在标准工作曲线上求得样品质量浓度再换算成含量，其含量分别为0.139，0.111，0.127 mg/kg，平均值X=0.126 mg/kg。

表1 标准曲线回归方程及线性表

标准曲线回归方程及线性表见表1。

标准曲线拟合产生的不确定度计算如下：

标准溶液浓度残差的标准偏差为

式中：m——标准溶液浓度点个数，m=5；n 为标准溶液测定次数，n=3；p 为待测物质测定次数，p=3；Ci 是标准溶液的平均质量浓度；Cx 为待测样品质量浓度，a 为斜率，b 为截距；Ai 为标准溶液的峰面积。Sy(6-BA)=2 380.4，U(Y)=0.069 27.

2.1.5 回收率测试过程中引入的不确定度U(f)

按照方法，在5 份样品中各加入质量浓度为0，5，10，50，100 ng/mL 的标准溶液，测定加标回收率分别为0，83.3%，88.2%，93.5%，95.3%。平均回收率f=90.0%，所建方法准确可靠。

平均值测量的标准偏差：

回收率f 引起的标准相对不确定度为Uref(f)=Sf÷f=0.030 1。

2.1.6 检测仪器引入的相对不确定度Uref(r)

根据《液相色谱- 串联质谱 仪器校准证书》可知，Uref(r)=2%。

2.2 标准不确定度的合成与扩展

2.2.1 合成标准不确定度

由于上述各因素的不确定度互不相关，合成豆芽中六苄基腺嘌呤含量的相对不确定度为：

合成不确定度：

2.2.2 扩展不确定度

在95%的置信水平下，k=2，则扩展不确定度U=k×Uh=0.026 0 mg/kg。

2.2.3 测定结果

测定豆芽样品6-BA 含量为：

3 结论

以豆芽为样品，采用超高效液相色谱- 串联质谱法对检测豆芽中6 - 苄基腺嘌呤残留量进行测定，通过不确定度评定分析，结果显示仪器及标准溶液配制和通过标准曲线拟合求得样品质量浓度值过程引起的不确定度最大，其次是前处理及标准品储备液和混合标准中间液配制过程带入的不确定度。因此，在实际试验中，要对样品前处理规范流程操作，选用精密性高的仪器进行检测，并对仪器进行定期保养与清洗，定期开展检定校准，以提高仪器的灵敏度，选用高精密度天平精密称量，高精密度移液枪、容量瓶进行溶液的配置，并定期进行校准工作，从而降低测量的不确定度，提高检测结果的准确度和可靠性。