关帝山不同海拔和季节对沙棘黄酮含量的影响

代永欣 薛静茹 杨 楠 李泽淇 侯 锐 杭宇杰 吕英忠 王 林，*

（1山西农业大学林学院，山西 太谷 030801；2山西农业大学果树研究所，山西 太谷 030815）

沙棘（HippophaerhamnoidesL.）是一种重要的经济树种，兼有生态、食用、药用等多种用途，是天然药食两用原料，被收载于《中华人民共和国药典（2020版）》［1］。黄酮类化合物是沙棘中主要的生物活性成分和特征成分，属于一大类酚类次生代谢产物，具有抗氧化活性，对植物起防御保护作用［2］。目前已从沙棘中鉴定出95种以上黄酮类化合物，主要是杨梅素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素等黄酮苷元及其苷类化合物［3-4］。研究发现沙棘果和叶片中均富含黄酮类化合物，国内外研究大多集中于沙棘果或叶片化学成分分析，及其抗氧化活性评价和比较［5-10］，而对于植物中生物量较高的茎（枝）器官的研究相对较少，这限制了对沙棘的全面利用。

次生代谢物质是植物适应生态环境的产物，植物体内黄酮类化合物含量与环境条件密切相关。有研究发现，大多数植物体内的黄酮类化合物含量随着光照强度的增强而升高［11］；短期、轻度干旱胁迫可促进植物次生代谢物质的积累［12］；低温可促进银杏（Ginkgo biloba）叶片类黄酮的积累［13-14］，可见黄酮类化合物含量在环境胁迫条件下呈升高趋势。海拔高度综合了温度、水分、光照等环境因子，同样会影响植物体内黄酮类化合物含量，Ma 等［15］发现随着海拔（210～3 000 m）的升高，不同地区的野生沙棘果实中黄酮醇苷含量呈上升趋势。沙棘常生长于海拔800～3 600 m 的温带地区，目前有关同一地区不同海拔高度对沙棘黄酮类化合物含量影响的研究鲜有报道，限制了对沙棘黄酮类化合物含量响应环境变化的全面了解，在实践上不能为沙棘黄酮高含量强化栽培模式提供理论依据和技术支持。

我国是世界上沙棘资源最丰富的国家，沙棘资源面积占全球沙棘总面积的90%以上［16］，境内分布最广的是中国沙棘（HippophaerhamnoidesL.subsp.sinensisRousi）亚种，在改良生态环境和发展当地经济方面发挥重要作用。近年来，沙棘的保健功能日益受到关注，植物化学成分含量高常被作为沙棘功能化利用的理想性状［17］。本研究以山西省关帝山区野生中国沙棘为研究对象，通过测定不同海拔、不同季节中国沙棘不同部位的总黄酮及其主要成分含量，分析沙棘一年生枝、叶、果实中黄酮类化合物含量对季节和海拔的响应，旨在揭示中国沙棘不同部位黄酮类化合物含量随生长季节、海拔高度的变化规律，为沙棘功能化利用及沙棘黄酮高含量强化栽培模式提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

本研究在山西省西部吕梁山脉，关帝山庞泉沟自然保护区（111°18'～112°18'E，37°20'～38°20'N，海拔2 831 m）进行。该区属温带大陆性季风气候，年平均气温4.3 ℃，1月份平均气温最低，为-10.2 ℃，7月份平均气温最高，为17.5 ℃。年均降水量为600～822 mm，降水主要集中在7、8月份。于2021年5月在1 150、1 400、1 650、1 800和2 100 m 海拔高度的天然沙棘灌木纯林各设置3个10 m×10 m样地，样地为阳坡或半阳坡，设置在坡中下部，样地的生长季平均气温和平均降水量［18］见表1。试验材料为所选定样地中的野生中国沙棘植株。

表1 关帝山季均温和季均降水量Table 1 Seasonal mean temperature and precipitation of Guandi mountain

1.2 试验方法

于2021年5月（春季）、7月（夏季）、9月（秋季）沿海拔梯度在每个样地中随机选择3 株野生中国沙棘平均木采集样品，5月尚无当年生枝条，只采集新生叶片，7月采集叶片和一年生枝，9月采集叶片、一年生枝和果实。叶片、枝条、果实均选择向阳面树冠中上部位置采集，将采集的样品在烘箱中105 ℃杀青，之后于85 ℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎至粉末状，过100 目筛，用于总黄酮及黄酮主要成分和非结构性碳含量测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 沙棘总黄酮含量的测定 采用粉碎过筛后的样品，参考任园宇等［19］的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法对总黄酮含量进行测定。

1.3.2 沙棘黄酮类化合物含量的测定 对黄酮类化合物中含量较多的杨梅素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素四种黄酮苷含量进行测定，参照卫罡等［20］的方法并稍作修改，具体如下：首先确定色谱分析条件，流动相为甲醇+0.4%磷酸水溶液（1∶1），色谱柱为WondaSilTM C18 Superb（4.6 mm×150 mm），柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长为360 nm。然后配制标准溶液，按色谱条件加样，以质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归分析（表2）。

表2 色谱分析线性回归方程Table 2 Linear regression equation for chromatographic analysis

称取粉碎过筛后的样品0.2 g置于100 mL烧杯中，加入30 mL甲醇，混匀，超声提取1 h，重复提取3次，合并提取液后用RE52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）进行浓缩至25 mL。加入25 mL 甲醇-25%盐酸溶液（4∶1），75 ℃水浴1 h，自然冷却后转入50 mL 量瓶中定容，用0.45 µm微孔滤膜过滤，所得滤液即为样品待测液。采用LC-20AT/SPD-M20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）进行测定。

1.3.3 沙棘生长指标的测定 于2021年5月在设置的样地中选取6株沙棘平均木，测量株高、冠幅。9月，在向阳面树冠中上部选择10个一年生枝条上的第3个成熟叶片，用YMJ-C 型叶面积扫描仪（浙江托普仪器有限公司）测定叶面积。

1.3.4 光合生理指标的测定 于2021年7月天气晴朗的上午9∶00—11∶30，在设定的样地中采用Li-6400光合仪（美国LI-COR 公司）随机测定沙棘植株中上部成熟叶片净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）和气孔导度（stomatal conductance，Gs）。其中，光合有效辐射（photosynthetically active radiation，PAR）设定为1 500 µmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 µmol·mol-1。

1.3.5 非结构性碳含量的测定 采用硫酸蒽酮法［21］测定粉碎过筛后的样品可溶性糖和淀粉含量，非结构性碳（nonstructural carbohydrates，NSC）含量为可溶性糖与淀粉含量之和。

1.4 数据处理

采用Excel 2019 软件进行数据统计和处理，结果以“平均值±标准差”表示；用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析、差异显著性比较（α=0.05）和相关性分析；利用Sigmaplot 10.0软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同海拔和季节条件下中国沙棘叶片黄酮类化合物含量

由图1 可知，不同海拔高度下，叶片总黄酮含量均为9月份最高，5月份最低（因5月高海拔植株尚未萌发叶片，故未采集到1 800 和2 100 m 处叶片），且随海拔升高整体呈先升高后降低趋势，在1 650 m处的9月份达到最大值，为17.32 mg·g-1。各黄酮类化合物含量变化并无统一规律，与总黄酮含量的变化趋势并不一致。随着海拔的升高，杨梅素含量先下降后上升，最大值出现在1 150 m 处的7月份，为1.12 mg·g-1；槲皮素含量整体先升高后降低，在1 800 m 处的9月份达到最大值，为2.21 mg·g-1；而9月份异鼠李素含量除在1 400 m 处略有下降外，基本呈上升趋势，在2 100 m 处达到最大值，为2.48 mg·g-1。说明除上述几种主要的黄酮类化合物外，其他类黄酮成分含量也会发生变化，从而导致总黄酮含量发生变化。

图1 不同季节沙棘叶片黄酮类化合物含量沿海拔的变化Fig.1 Changes of flavonoids contents of leaves in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.2 不同海拔和季节条件下中国沙棘一年生枝黄酮类化合物含量

由图2 可知，与叶片相反，不同海拔高度一年生枝总黄酮含量均表现为7月高于9月，除海拔1 800 m外，随海拔的升高呈略上升趋势，最大值为4.90 mg·g-1。黄酮类化合物杨梅素、山奈酚、槲皮素、异鼠李素基本呈相似的变化趋势，均在7月份随海拔升高整体呈下降趋势，9月份沿海拔升高呈略升高趋势，几种黄酮类化合物7月份含量最高值均在1 150 m 处，9月份含量最高值均在2 100 m处。

图2 不同季节沙棘一年生枝黄酮类化合物含量沿海拔的变化Fig.2 Changes of flavonoids contents of one-year-old branches in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.3 不同海拔中国沙棘果实黄酮类化合物含量

由图3可知，果实总黄酮含量沿海拔梯度呈先升高后下降变化趋势（海拔2 100 m 处植株未结实，故未采集到），1 650 m处显著高于其他海拔，为10.31 mg·g-1。杨梅素含量随海拔升高而逐渐升高，最大值在1 800 m处，为0.52 mg·g-1。山奈酚含量在各海拔间无显著差异，维持在0.35 mg·g-1左右。槲皮素和异鼠李素含量随海拔升高而逐渐降低，最大值在1 150 m 处，分别为0.53和0.78 mg·g-1。

图3 沙棘果实黄酮类化合物含量沿海拔的变化Fig.3 Changes of flavonoids contents of berries along altitude in sea buckthorn

2.4 不同海拔中国沙棘的生长情况和光合指标

由表3可知，中国沙棘的株高和冠幅整体均随海拔高度的增加呈先升高后降低趋势。其中株高在1 400 m处达到最大值，为3.6 m；冠幅在1 650 m处达到最大值，为2.3 m，显著高于其他海拔。叶面积在1 650 m处达到最大值，为326.55 mm2，除略高于2 100 m处外，显著高于其他海拔。净光合速率和气孔导度整体均随海拔高度的增加呈升高趋势，均在2 100 m处达到最大值，分别为18.34 µmol CO2·m-2·g-1和1.65 mmol H2O·m-2·g-1。

表3 不同海拔沙棘的株高、冠幅、叶面积、净光合速率和气孔导度Table 3 Plant height，crown width，leaf area，net photosynthetic rate and stomatal conductance of sea buckthorn at different altitudes

2.5 不同海拔和季节条件下中国沙棘的非结构性碳含量

由图4 可知，叶片、一年生枝、果实中不同季节淀粉和可溶性糖含量随海拔升高整体均呈先升高后降低趋势，均在1 650 m 处达到最大值。对于同一部位，各海拔一年生枝可溶性糖和NSC 含量均表现为7月＞9月，各海拔叶片可溶性糖和NSC含量表现为5月＞7月＞9月；对于同一海拔，7月一年生枝可溶性糖和NSC 含量均大于叶片，9月为果实＞一年生枝＞叶片，果实NSC含量最大为17%左右，一年生枝和叶片NSC 含量最大接近14%。

图4 不同季节沙棘不同部位NSC含量沿海拔的变化Fig.4 Changes of NSC content of different parts in different seasons along altitude in sea buckthorn

2.6 不同海拔中国沙棘黄酮类化合物含量与生长和生理指标的关系

通过对9月中国沙棘果实和叶片总黄酮及其成分含量与气候因子、海拔、生长和生理指标进行相关性分析，发现果实总黄酮含量与果实可溶性糖、果实NSC、叶片可溶性糖、叶片NSC 含量呈极显著正相关，叶总黄酮含量与果实可溶性糖和果实NSC 含量呈显著正相关。果实杨梅素和叶槲皮素含量与海拔极显著正相关，而果实槲皮素和果实异鼠李素含量与海拔极显著负相关；果实杨梅素含量与季均温呈极显著负相关，与季均降水量呈显著或极显著正相关；果实槲皮素含量则与季均温呈极显著正相关，与季均降水量呈极显著负相关。果实槲皮素和果实异鼠李素含量还与净光合速率、叶面积等指标呈显著或极显著负相关（表4）。

表4 沙棘黄酮类化合物与生长指标、气候指标、碳代谢之间的相关性Table 4 Results of correlation analysis between flavonoids and growth indexes，climate indexes and carbon metabolism in sea buckthorn

3 讨论

3.1 海拔高度和季节对中国沙棘黄酮类化合物含量的影响

海拔变化可引起复杂的环境变化，从而引起黄酮类化合物含量的变化。前人研究发现，黄芩、软枣猕猴桃、长白山笃斯越桔、祁连圆柏、杜松、红豆杉等植物的酚类物质或总黄酮含量均随海拔升高而升高［22-27］。而本研究中，野生中国沙棘叶片、一年生枝、果实中总黄酮含量均随海拔梯度（1 150～2 100 m）呈先升高后下降趋势，整体以1 650 m 处的含量最高。一般来说，随着海拔升高，紫外线辐射增强，黄酮类化合物可增强植物应对紫外线辐射的能力，紫外光调控了黄酮类化合物合成过程中的酶活性，从而促进黄酮类化合物的合成［11］。也有研究表明，低温（4或5 ℃）处理有利于黄酮类化合物的积累［28-29］。本研究海拔1 650 m处春、秋季均温分别为5.6 和4.7 ℃，与文献［28-29］中可促进黄酮类化合物积累的温度接近，说明适度低温有利于黄酮类化合物的积累，海拔过高导致温度过低，可能对植物生长不利。本研究还发现，四种主要类黄酮成分含量随海拔的变化趋势并不一致，原因可能是不同黄酮成分的作用机制和调控机制不同，具体有待进一步深入研究。

在比较沙棘叶片和果实黄酮含量的研究中，都一致报道了同一沙棘株系叶片总黄酮含量高于果实［2，30-33］，对枝的研究相对较少，有研究发现沙棘枝中总黄酮含量远低于叶片［34-35］。本研究发现，中国沙棘总黄酮含量表现为叶片＞果实＞一年生枝，与前人研究结果基本一致［34-35］。同时，叶片总黄酮含量也存在季节变化，表现为9月＞7月＞5月，说明随着叶龄的增加，黄酮类化合物在叶中的积累也增加。一年生枝的总黄酮含量在同一海拔表现为7月高于9月，与叶片呈现不一致的规律，但一年生枝中最大总黄酮含量远低于叶片和果实，利用价值不大。胡建忠等［8］研究发现，人工种植的中国沙棘叶片总黄酮含量在5—7月高于8—9月，与本研究结果相反，可能是因为总黄酮含量受季节和环境因素的共同影响，本研究所在地为关帝山区，海拔是主要影响因素。

3.2 生长和碳代谢对不同海拔中国沙棘黄酮类化合物含量的影响

本研究发现，中国沙棘在海拔1 650 m处于良好的生长状态。前期研究也发现低海拔和高海拔均对中国沙棘生长产生抑制，低海拔主要受干旱胁迫影响，高海拔的低温、生长季缩短同样不利于中国沙棘生长［36］。虽然有研究发现干旱胁迫可促进次生代谢物的积累，但长期、重度干旱胁迫则不利于次生代谢物积累［12］。较多研究观察到短期、轻度干旱条件下，植物体内会有一个碳积累的过程［37］，该时期植物可能会产生更多的次生代谢物质用于防御。但在重度或长期干旱条件下，植物体内水分输导严重受阻，储存碳逐渐被消耗导致碳供需失衡，植物不可能将储存碳用于合成次生代谢物［38］。因此，黄酮的积累也是植物生长和碳代谢权衡的结果，在不影响植物正常生长的情况下，适度胁迫有利于黄酮积累。

关帝山区中国沙棘的净光合速率随海拔升高呈现升高趋势，在2 100 m处达到最大值。众多研究提出植物存在水-碳耦合机制，其中之一体现在光合作用对水分状况的依赖上［39］。随着海拔的升高，关帝山区降水增多，净光合速率也随之增大。但是较高的净光合速率并未转化为高水平的非结构性碳（NSC），中国沙棘各个部位NSC含量在2 100 m处反而下降，可能是由于高海拔处叶面积降低、日光合有效时间及生长季缩短导致光合产物含量降低。中国沙棘叶片、一年生枝、果实NSC和可溶性糖含量均在1 650 m处达到最大值，树木生长状况也优于其他海拔，表明此处树木光合产物供应充足。NSC主要为各种生理过程提供能量和代谢中间产物，为结构物质和功能分子提供配基，很多黄酮类成分即是与糖基结合形成黄酮醇苷类化合物［4］。因此，NSC不足不仅会影响植物的生理代谢过程，也会影响黄酮类化合物的合成，而光合产物供应充足有利于黄酮类化合物的积累。

4 结论

关帝山野生中国沙棘总黄酮含量表现为叶片＞果实＞一年生枝，均随海拔高度（1 150～2 100 m）的增加呈先升高后降低趋势，在中海拔（1 650 m）处达到最大值。叶片总黄酮含量在9月最高。1 650 m 处植株综合生长状况最好，叶片、一年生枝和果实非结构性碳（NSC）含量最高。果实总黄酮含量与果实可溶性糖、果实NSC、叶片可溶性糖、叶片NSC 含量呈极显著正相关。叶片总黄酮含量与果实可溶性糖和果实NSC 含量呈显著正相关。果实杨梅素和叶槲皮素含量与海拔呈极显著正相关，而果槲皮素和果异鼠李素含量与海拔呈极显著负相关。表明中海拔（1 650 m）中国沙棘的叶片和果实是黄酮含量较高的部位，生长季后期黄酮在叶片积累较多，沙棘体内总黄酮含量除受环境条件影响外，还与植物生长状况和碳代谢密切相关。