桉木屑栽培毛木耳的食用安全性评价

罗阳兰 王灿琴，* 韦娇君 阎 勇 吴圣进 韦仕岩 胡秀月

（1广西壮族自治区农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007；2田林县经济作物试验站，广西 百色 533300）

毛木耳（AuriculariacorneaEhrenb.），隶属于担子菌门（Basidiomycota）木耳属（Auricularia），是一种高蛋白、低脂肪的珍稀菌类，属食药两用性食用菌［1］，具有降血脂、抗凝血、抗肿瘤［2］、抗氧化［3］、抗突变和免疫调节［4］等多种生物学功能，富含多种蛋白质、氨基酸、多糖［2］和黄酮［5］等营养物质，也是我国广西壮族自治区的地方特色小吃柳州螺蛳粉的重要原料之一［6］。随着螺蛳粉和食用菌产业的发展，成本的攀升制约着产业的良性运转。毛木耳的代料栽培基质多以杂木屑、玉米芯和棉籽壳为主［5］。因此，如何为毛木耳寻求新型、廉价的食用菌栽培基质成为研究热点。

广西的桉树人工林面积以约200 万亩居全国首位，年产桉树木材2 000 万m3以上［7］，其中，主要桉树加工副产物——桉木屑及边材约为300 万t。长期以来，桉树加工副产物资源化利用程度低，除部分用于制浆造纸原料、直接和间接燃料外，相当一部分直接被填埋或焚烧［8］，造成资源浪费和环境污染。近年来，大多数研究集中于探索桉木屑应用于食用菌栽培的可能性［9］，及其对菌丝生长速度、生物转化率和菌包污染率的影响［10］，而对桉木屑在食用菌栽培过程中的食用安全性评价鲜见报道。

本研究采用国家标准规定方法对桉木屑栽培毛木耳的常规营养成分和食用安全性进行评价，探究桉木屑栽培基质对毛木耳常规营养成分和食用安全性的影响，以期为桉木屑应用于食用菌栽培提供理论基础，并促进桉树产业和食用菌产业共同健康、快速、可持续性发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桉木屑栽培的毛木耳子实体由广西壮族自治区农业科学院微生物研究所提供。毛木耳子实体经50 ℃恒温烘干后，用中药粉碎机粉碎，过60目筛备用。

急性经口毒性试验动物来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级BalB/c小鼠、32只+2只检疫、雌雄各半、6周龄，雄性小鼠最初体重范围为23.9～26.1 g，雌性小鼠最初体重范围为20.9～23.2 g。常规小鼠饲料种类为普通饲料，北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养环境为温度22～26 ℃，相对湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h。动物生产许可证号：SYXK（鄂）2018-0104，动物合格证号：No.430727221101113026。

长期毒性试验动物来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF级BalB/c小鼠，雌雄各半、50只+2只检疫、6 周龄，雄性小鼠最初体重范围为19.1～20.0 g，雌性小鼠最初体重范围为17.5～18.5 g。常规小鼠饲料种类为普通饲料，北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养环境为温度22～26 ℃，相对湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h。试验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0104，动物合格证号：No.430727221101442123、No.430727221101442273。

二甲苯、无水乙醇、碳酸锂、冰醋酸，国药集团化学试剂上海有限公司；伊红、中性树脂，北京索莱宝科技有限公司；苏木素，武汉赛维尔生物科技有限公司；戊巴比妥钠（批号：P3761），美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

GC2010plus 气相色谱仪、AA-6880 原子吸收分光光度计，日本岛津仪器有限公司；1260 高效液相色谱，美国安捷伦科技有限公司；FP640 火焰分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；OLB9870A 全自动定氮仪，济南欧莱博技术有限公司；T6 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；WA1020 显微剪、WA3040 显微镊、DM1000 正置显微镜、RM2235 石蜡切片机、Leica Application Suite 图象系统，德国徕卡显微系统有限公司；DHG-9023A 恒温烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；TKD-TK摊片烤片机、TKD-TSF自动组织脱水机，湖北康强医疗器械有限公司；TB-718L 生物组织包埋机-冷冻机、TB-718D 生物组织包埋机，湖北泰维科技实业股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 常规营养成分测定 水分含量按照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》［11］测定，蛋白质含量按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》［12］测定，脂肪含量按照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》［13］测定，可溶性糖含量按照NY/T 1278-2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定 铜还原碘量法》［14］测定，粗纤维含量按照GB/T 5009.10-2003《植物类食品中粗纤维的测定》［15］测定，粗灰分含量按照LY/T 1268-1999《森林植物与森林枯枝落叶层粗灰分的测定》［16］测定。

1.3.2 安全性评价指标

1.3.2.1 重金属含量测定 铅含量按照GB 5009.12-2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》［17］测定，镉含量按照GB 5009.15-2014《食品安全国家标准 食品中镉的测定》［18］测定，汞含量按照GB 5009.17-2014《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》［19］测定，砷含量按照GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》［20］测定，铬含量按照GB 5009.123-2014《食品安全国家标准 食品中铬的测定》［21］测定，锡含量按照GB 5009.16-2014《食品安全国家标准 食品中锡的测定》［22］测定，镍含量按照GB 5009.138-2017《食品安全国家标准 食品中镍的测定》［23］测定。

1.3.2.2 农药残留含量测定 百菌清、三唑酮、异菌脲、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、乐果、敌百虫、灭线磷、毒死蜱、马拉硫磷、水胺硫磷、三唑磷含量均按照NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》［24］测定；吡虫啉含量按照GB/T 23379-2009《水果、蔬菜及茶叶中吡虫啉残留的测定高效液相色谱法》［25］测定。

1.3.2.3 急性经口毒性试验 急性经口毒性以经口半数致死量（median lethal dose，LD50）表示，试验依照GB 15193.3-2014《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》［26］，同时结合毛木耳粉末溶解度进行。小鼠适应性饲养7 d 后，将动物根据体重平均分为4 组，每组小鼠8 只，雌雄各半。分为对照组（灌胃给予等量生理盐水）；试验组（低剂量组、中剂量组和高剂量组）每日灌胃20 mL·kg-1BW 溶解于生理盐水的毛木耳溶液，灌胃剂量分别为0.50、1.00和2.00 g·kg-1BW，连续灌胃7 d。灌胃7 d 后，BALB/c 小鼠采用眼眶取血，将全血分为两份，一份直接转移至-80 ℃冰箱保存，一份室温自然凝固10 min 后1 295×g离心分离血清，于-80 ℃冰箱保存。每只动物的心、肝、脾、肾脏组织分为两份，一份取下后立即放入冰盒，取材完毕后转移至-80 ℃冰箱暂存，另一份浸泡在4%多聚甲醛中进行固定，准确称量各脏器重量，计算小鼠脏器指数。

1.3.2.4 长期毒性试验 试验选用6 周龄SPF 级BalB/c小鼠50只+2只检疫，雌雄各半，饲养环境为温度22～26 ℃，相对湿度50%～60%，人工光照明暗各12 h。试验分为对照组（灌胃给予等量生理盐水）；试验组（剂量1组、剂量2组、剂量3组和剂量4组），灌胃剂量分别为0.50、1.00、1.58 和2.00 g·kg-1BW，每日1 次，连续8周。小鼠采用1%戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，采血测定血液学、血清生化学指标。迅速收集心、肝、脾、肾并准确称量各脏器重量，计算小鼠脏器指数，肉眼观察后放入10%甲醛中性缓冲液中固定，石蜡切片、苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色、200倍光学显微镜下观察各脏器的组织学变化，使用Leica Application Suite 图象系统采集样本心、肝、脾、肾各脏器图片。

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0 统计软件对数据进行相关处理和分析，用Duncan 多重比较检验各处理平均值之间的差异显著性，以P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。所有数据采用3次平行试验的平均值作为最后结果。

2 结果与分析

2.1 常规营养成分含量

营养成分含量检测发现，桉木屑毛木耳的水分92.31%、蛋白质12.82%、粗脂肪0.90%、可溶性糖3.78%、粗纤维13.00%、粗灰分8.30%，而常规基质杂木屑毛木耳的水分91.54%、蛋白质8.90%、粗脂肪1.72%、可溶性糖2.61%、粗纤维16.4%、粗灰分6.22%。因此，与常规基质杂木屑毛木耳的营养成分相比，利用桉木屑栽培的毛木耳粗蛋白、可溶性糖和粗灰分含量较高，而粗脂肪、粗纤维含量则较低。

2.2 安全性评价指标含量

2.2.1 重金属含量 桉木屑毛木耳的重金属含量见表1。桉木屑毛木耳的主要重金属含量均符合食品安全国家标准GB 2762-2022《食品安全国家标准 食品中污染物限量》［27］。因此，桉木屑毛木耳的重金属含量处于安全范围。

表1 桉木屑毛木耳的重金属含量Table 1 The heavy metal content in Auricularia cornea Ehrenb.planted with eucalyptus sawdust/（mg·kg-1）

2.2.2 农药残留含量 根据国家检测标准对常用大宗农药品种百菌清、三唑酮和异菌脲等21 种农药残留在桉木屑毛木耳中的含量进行检测。如表2所示，上述农药在桉木屑毛木耳中均未检出，即不存在农药残留，表明桉木屑毛木耳生产过程中，栽培原料和栽培环境均未使用上述农药，生产过程绿色、安全。

表2 桉木屑毛木耳的农药残留含量Table 2 The pesticide residu content in Auricularia cornea Ehrenb.planted with eucalyptus sawdust /（mg·kg-1）

2.2.3 急性经口毒性试验结果 试验选用小鼠32只+2

只检疫，检疫小鼠通过粪便虫卵确定动物无蛔虫、绕虫、条虫、钩虫或其他肠道寄生虫，通过胶带沾取观察确定无螨虫、跳蚤或其他皮肤寄生虫，通过血液聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测确定不携带鼠痘病毒、沙门氏菌病毒、流行性出血热病毒、狂犬病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒及其他病原微生物。根据标准中限量法测定桉木屑毛木耳急性经口毒性（LD50），试验结果见表3和表4。

表3 桉木屑毛木耳急性经口毒性（LD50）试验结果Table 3 The results of acute oral toxicity test of Auricularia cornea Ehrenb.planted with eucalyptus sawdust

表4 小鼠脏器指数Table 4 Organ index of mice

给样后各剂量组小鼠未见有中毒反应，饮食活动正常，观察期内试验动物无死亡，由表3 可知，各剂量组雄性小鼠和雌性小鼠7 d 后的体重与对照组具有显著差异（P＜0.05）。试验结果表明，雌、雄性小鼠经口LD50＞2.00 g·kg-1BW，已达受试小鼠最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃体积），说明桉木屑毛木耳属无毒级食品。各组小鼠的心、肝、脾和肾器官外观正常，未见异常变化，由表4 可知，试验中各剂量组雄性小鼠和雌性小鼠的心、肝和肾脏器指数，以及雄性小鼠脾脏脏器指数与对照组差异不显著（P＞0.05），各剂量组雌性小鼠的脾脏脏器指数与对照组相比整体差异显著（P＜0.05），但无剂量相关性，表明并非给药引起的差异。根据文献［28］可知，正常小鼠的理论脾脏重量为体重的0.38%，本试验对照组小鼠实际脾脏重量为77.14 mg，小于理论脾脏重量101.08 mg。各剂量组雌性小鼠的脾脏重量为73.33～90.30 mg，小于对照组小鼠的理论脾脏重量101.08 mg，表明虽然各剂量组雌性小鼠的脾脏脏器指数与对照组相比差异显著，但并未引起脾脏重量的异常增加，即未表现出毒性。

2.2.4 长期毒性试验结果

2.2.4.1 对动物临床症状的影响 试验选用小鼠50 只+2 只检疫，饲喂桉木屑毛木耳样品共8 周，观察到小鼠进食、进水、活动、毛色、躯体运动、体温等一切正常，未出现不良反应或死亡现象。

2.2.4.2 对动物体重和摄食量的影响 与对照组相比，各剂量组小鼠体重结果见表5，部分剂量组和对照组的小鼠体重存在显著差异（P＜0.05），剂量组中的雌性动物和雄性动物体重均小于生理盐水对照组。饲喂期间小鼠摄食量均低于空白对照组，且差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 桉木屑毛木耳长期毒性试验结果Table 5 The results of long term toxicity test of Auricularia cornea Ehrenb.planted with eucalyptus sawdust

2.2.4.3 对动物脏器重量和脏器指数的影响 由表6可知，饲喂桉木屑毛木耳后，除雌性小鼠0.50 g·kg-1BW剂量组与对照组的脾脏脏器指数有显著差异（P＜0.05）外，其余各剂量组雌性和雄性小鼠心、肝和肾的脏器指数，以及雄性脾的脏器指数与对照组均无显著差异（P＞0.05）。

表6 小鼠脏器指数Table 6 Organ index of mice

2.2.4.4 对小鼠血液学指标的影响 饲喂8 周后，分别对小鼠白细胞（white blood cell，WBC）、红细胞（red blood cell，RBC）、血红蛋白（hemoglobin，HGB）、红细胞压积（hematocrit，HCT）、红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）、平均血红蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、平均血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、血小板（platelet，PLT）、中性粒细胞（neutrophil，NEU）、淋巴细胞（lymphocyte，LYM）、单核细胞（monocytes，MON）、嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）、嗜碱性粒细胞（basophil，BAS）进行测定，结果见表7。雄性小鼠剂量组的MCV 和BAS 与对照组相比无显著差异（P＞0.05），其余指标部分剂量下有显著差异（P＜0.05）；雌性小鼠各项指标部分剂量下有显著差异（P＜0.05），但无剂量相关性。

表7 对小鼠血常规指标的影响Table 7 Effect on blood routine indexes of mice

2.2.4.5 对小鼠血清生化指标的影响 饲喂8 周后，各剂量组中雄性（图2）和雌性（图3）的甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL）浓度与对照组相比在部分剂量下有显著差异（P＜0.05），但无剂量相关性。

图2 雄性小鼠血清生化指标Fig.2 Serum biochemical indexes of mal e

图3 雌性小鼠血清生化指标Fig.3 Serum biochemical indexes of female

2.2.4.6 解剖及病理组织学检查 饲喂8 周后，进行解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、生殖系统、胃肠道等各脏器或组织大小、形态、颜色、质地均未见异常病变。图4 显微镜结果表明，各组织均无异常病变，肝组织结构正常，肝细胞无空泡变性，组织内未见明显炎症细胞浸润；脾组织结构正常，红髓及白髓结构清晰；肾组织结构正常，肾小管结构清晰，未见异常；心组织结构正常，未出现炎症细胞浸润。

图4 主要脏器组织病理切片Fig.4 Pathological sections of main organs

3 讨论

栽培条件是影响食用菌风味成分产生的重要因素之一［10］，而营养物质的含量水平是影响食用菌品质的重要因素［29］。本研究显示，与杂木屑毛木耳的营养成分相比，桉木屑毛木耳的粗蛋白、可溶性糖和粗灰分含量较高，而粗脂肪、粗纤维含量则较低。李阿池等［30］研究发现，桉木屑栽培毛木耳的营养成分含量均高于油桐木，这与本试验结果相似。不同栽培基质会对食用菌子实体产量、基本营养成分、酶活性以及次级代谢产物等产生较大影响［31］。陈丽新等［32］发现，桉树屑栽培平菇的水含量、粗蛋白质、粗脂肪、总糖含量均高于棉籽壳栽培平菇。本研究发现，桉木屑栽培毛木耳的粗蛋白、可溶性糖和粗灰分含量较高，可见，桉木屑栽培具有提高毛木耳蛋白和多糖等营养物质含量水平，进而提高其风味和品质的潜力。

随着人工栽培食用菌的农药残留问题逐渐显露，农药残留过量成为我国食用菌产业比较集中的问题［33］。本研究发现，桉木屑毛木耳中未检出常用大宗农药品种百菌清、三唑酮和异菌脲等21 种农药，即不存在农药残留问题。食用菌对重金属的吸收和富集能力远远高于普通作物［34］。重金属进入人体蓄积后可能带来系统性的健康隐患，因此重金属污染评价是食用菌食品安全评价研究中不可缺少的部分，预防和控制重金属污染是食品安全风险管理的关键点［35］。刘春丽等［10］发现，桉木屑栽培黑木耳金属含量及氨基酸含量与杂木屑无明显差异，各成分指标均符合黑木耳国家标准及国家标准食品中污染物限量的要求，表明桉树栽培黑木耳可行。本研究结果同样表明，利用桉木屑栽培的毛木耳子实体中的铅、镉、砷等多种常见重金属含量均未超出国家标准，进一步表明利用桉木屑栽培的毛木耳符合国家安全标准。

急性毒性试验作为检测和评价受试物毒性作用最基础的试验，是毒理学评价中的第一阶段，通过记录试验动物的中毒体征和死亡情况，可为毒理学研究提供剂量依据和相关观察指标基础［36］。付珂等［37］发现，西藏黑木耳的急性毒性试验中，对小鼠的最大给药量为12.14 g·kg-1BW，此剂量下未见动物死亡、中毒症状和肉眼可见的脏器异常，体重和饲料消耗量无明显变化，表明西藏黑木耳的安全性良好。本研究急性毒性试验中的心、肝、脾、肾等指标基本未出现与受试物相关的明显改变，急性经口LD50＞2.00 g·kg-1BW，高于最大剂量，属无毒级食品。与付珂等［37］一次性给药12.14 g·kg-1BW 不同，本试验高剂量组采用每次给药2.00 g·kg-1BW，连续给药7 d期间不喂食饲料的试验方案，主要是由于所用毛木耳的最大剂量只有2.00 g·kg-1BW，这可能是导致给药组小鼠体重总体均低于对照组的原因。长期毒性试验中，对照组与剂量组均未见明显的毒性反应。剂量组的参数指标与对照组相比存在一定的统计学差异，但无剂量相关性，分析应非样品本身的毒性所致，不具有毒理学意义。心脏、肾脏、肝脏及脾脏均为动物机体主要的器官，其中肾脏和肝脏是毒性作用的主要靶器官［38］，本研究长期毒性结果显示，通过剖检和组织学观察主要内脏器官的形态、组织结构均未发现异常变化，即未发现桉木屑毛木耳子实体存在明显的长期毒性。试验结果表明，桉木屑毛木耳子实体具有较高的食用安全性。但是，一方面，由于毛木耳含大量胶质性成分，吸水膨胀度大（吸胀后体积可膨胀10倍左右）；另一方面，由于人对毛木耳的摄入量较大，造成了动物给药剂量不能增加，相对于人常规食用量倍数难以进一步扩大，从而使其毒性不能充分暴露［39］。因此，后续试验应改进加工方式，提高给药量以充分研究其安全性。此外，毛木耳在生产栽培过程中应加强微生物污染（如椰毒假单胞菌）的风险评估，同时在食用过程中若长时间（2 d以上）浸泡易滋生其他病原菌，有造成食物中毒的风险［40］。

4 结论

本研究采用国家标准规定方法对桉木屑栽培毛木耳的常规营养成分和食用安全性进行评价，发现桉木屑毛木耳粗蛋白、可溶性糖和粗灰分含量高于杂木屑毛木耳；重金属元素铅、镉、汞、砷、铬、锡和镍含量均低于国家标准中的限量要求，且不存在农药残留情况；急性经口毒性试验证明，小鼠经口LD50＞2.00 g·kg-1BW，桉木屑毛木耳为无毒级食品；长期毒性试验结果表明，与对照组比较，试验组小鼠体重、摄食量、脏器指标、血液学指标、血清生化学指标和主要脏器病理学检查均无明显异常。综上，桉木屑用于栽培毛木耳的食用安全性较高。