γ射线辐照协同水热处理制备油茶壳低聚木糖的工艺研究

武小芬 彭炜煜 沈晓岩 王 岩 齐 慧 刘 安苏小军 陈 亮，*

（1湖南省农业科学院，湖南省核农学与航天育种研究所，湖南 长沙 410125；2湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；3湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125）

油茶（CamelliaoleiferaAbel）是世界四大木本油料作物之一，2022年全国油茶种植面积约7 000 万亩（1 亩≈666.67 m2，下同），根据国家林业和草原局等发布的《加快油茶产业发展三年行动方案（2023—2025年）》［1］，预计2025年油茶种植面积达9 000 万亩，产业发展潜力巨大。油茶壳作为茶油加工的主要副产物，占茶果鲜重的50%～60%，是宝贵的生物质资源［2］。但作为副产物的油茶壳利用率较低，通常被丢弃或焚烧，不仅造成资源浪费，还造成土壤/地下水污染和温室气体排放［3］。油茶壳中含有丰富的木质纤维素组分，其中木聚糖含量可达22.33%［4］。因此，采用油茶壳木聚糖制备低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）能够促进油茶壳资源的高值化利用［5］。

低聚木糖一般指聚合度为2～7 的木糖聚合物，具有促进有益菌增值、预防便秘和结肠癌、降低血清胆固醇浓度等作用，主要制备方法包括物理法、化学法和酶水解法等［4，6-7］。其中，物理法处理过程简单、环境友好，制备的低聚木糖纯度较高，但得率低［8］；化学法主要以酸水解为主，具有操作简单、成本低等优点，但降解产物复杂、易造成环境污染［9］；酶法具有副产物少、环境友好、产品得率高等优点，但酶成本较高［10］。水热处理技术以水作为反应的唯一溶剂，通过水自电离产生水合氢离子攻击半纤维素的糖苷键、O-乙酰基和O-葡萄糖醛酸基，产生乙酸和葡萄糖醛酸等有机酸，催化半纤维素的解聚［11-12］。Moniz 等［13］在210 ℃下水热处理稻草制备低聚木糖的得率为40.10%。Zhang等［14］采用白桦木屑中乙酰基催化甘蔗渣水热处理制备低聚木糖，当甘蔗渣/白桦比为65∶35 时，160 ℃反应100 min，低聚木糖得率为49.64%，200 ℃反应10 min，得率提高到52.99%，均高于单一甘蔗渣水热处理。

尽管水热处理能够有效解聚木聚糖制备低聚木糖，但单一水热处理低聚木糖得率相对较低，需要通过协同处理或加入催化剂来提高低聚木糖转化率。辐照技术作为一种非热、绿色的预处理方法，可破坏木质纤维素结构，使多糖链发生断裂形成羧基和醛基，并可催化木聚糖的水热解聚［15-17］。因此，本试验以0～1 000 kGy 辐照处理的油茶壳为原料，通过单因素和正交试验研究γ 射线辐照协同水热处理油茶壳生产低聚木糖的工艺，旨在实现油茶壳木聚糖高效制备低聚木糖的目标，为油茶壳资源高效利用提供理论依据，同时助力于提升油茶产业经济效益和推动产业高质量发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶壳由湖南大三湘茶油有限公司提供，自然晾干后备用。

葡萄糖、木糖标准品，美国Sigma公司；浓硫酸，上海国药集团化学试剂有限公司；试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

FW 177 高速粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；JJ-6恒速搅拌器，江苏金仪仪器科技有限公司；DZKWs-4电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；GZX-9246电热鼓风干燥箱、SHZ-C 水浴恒温振荡器、YXQ-50 SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BLUE STARA 紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；Ulti Mate 3000 高效液相色谱，美国赛默飞世尔科技有限公司；Eco-S 15纯水系统，上海和泰仪器有限公司；雷诺PHS-3 C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辐照处理 将自然晾干的油茶壳装于40 cm×20 cm×20 cm 金属辐照箱中进行动态辐照处理。辐射源为钴-60，源活度2.96×1016Bq，吸收剂量率为2 kGy·h-1，辐照吸收剂量分别为0（未处理的油茶壳，对照）、200、400、600、800、1 000 kGy。辐照处理后样品粉碎过40目筛、装于自封袋中备用。

1.3.2 单因素试验 按固液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20 g·mL-1，分别称取一定量0、200、400、600、800、1 000 kGy 辐照处理的油茶壳粉末装于100 mL 立式不锈钢高压反应器中，置于带磁力搅拌功能的油浴锅中于80、100、120、140、160、180、200、220 ℃进行水热处理10、20、30、40、50、60 min。样品经水热处理后，冷却，6 000 r·min-1离心10 min，收集滤液，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）直接测定木糖含量；另外，取7 mL 滤液加入0.25 mL 72%的硫酸，置于高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃水解60 min，采用HPLC 测定酸解滤液中的木糖含量，通过公式（1）和（2）计算木糖和低聚木糖转化率［11］。

式中，m1为油茶壳粉绝干质量（g）；m2为水热处理液中的木糖质量（g）；m3为水热处理液酸解后的木糖质量（g）；p为油茶壳中木聚糖百分含量（%）。

1.3.3 正交试验设计 在单因素试验基础上，以吸收剂量（A）、水热处理温度（B）、水热处理时间（C）、固液比（D）为因素，以低聚木糖转化率为指标，进行四因素三水平的正交试验设计，确定γ 射线辐照协同水热处理制备低聚木糖的最佳工艺。因素与水平见表1。

表1 正交试验设计因素与水平Table 1 Factors of orthogonal array design

1.3.4 验证试验 以未辐照（0 kGy）油茶壳为对照，对单因素和正交试验获得的最优条件进行验证，水热处理方法按1.3.2进行。

1.3.5 油茶壳水溶性组分和木聚糖含量测定 称取3.0 g（精确至0.000 1 g）油茶壳粉，按固液比1∶30 g·mL-1加90 mL 去离子水于三角瓶中，于50 ℃、130 r·min-1反应120 min，滤纸过滤，滤液采用HPLC 分析葡萄糖、木糖含量，并测定pH 值；取7 mL 滤液加入0.25 mL 72%硫酸121 ℃反应60 min，HPLC 测定酸解后的葡萄糖和木糖含量；滤渣采用少量去离子水冲洗，于105 ℃烘箱中烘干至恒重，用于测定油茶壳木聚糖含量［18］。根据公式（3）计算水溶性组分含量。

式中，m1为油茶壳粉绝干质量（g）；m2为水洗后滤渣绝干质量（g）。

参照美国国际可再生能源实验室分析方法测定油茶壳中木聚糖含量［19］。称取1.3.5 中烘干后滤渣0.3 g（精确至0.000 1 g）于三角瓶内，加入3 mL 72%的硫酸，于30 ℃水浴反应60 min。随后加入84 mL 蒸馏水将硫酸浓度稀释至4%，放入高压蒸汽灭菌锅中121 ℃反应60 min，反应结束后冷却、过滤，滤液用去离子水稀释至合适倍数后，采用HPLC 测定木糖含量，根据公式（4）计算油茶壳中木聚糖含量。

式中，m1为油茶壳粉绝干质量（g）；m2为HPLC 测定的木糖质量（g）；0.88为木聚糖与木糖转换系数。

1.3.6 葡萄糖和木糖含量的测定 采用高效液相色谱测定葡萄糖和木糖含量。色谱柱为Aminex HPX-87H（7.8 mm×300 mm）、柱温55 ℃，流动相为0.005 mol·L-1硫酸、流速0.6 mL·min-1，示差折光检测器（温度45 ℃），进样体积10 µL［20］。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 和Origin 2019 软件进行数据分析和绘图，采用SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析（Duncan’s新复极差法）和正交试验结果分析。

2 结果与分析

2.1 辐照处理对油茶壳木聚糖和水溶性组分含量的影响

不同吸收剂量处理的油茶壳水溶性组分和木聚糖含量见表2。未辐照油茶壳中木聚糖含量为21.45%，随着吸收剂量的增加，木聚糖含量呈下降趋势，1 000 kGy 辐照处理油茶壳中木聚糖含量降至最低值11.77%。在0～600 kGy 范围，油茶壳水溶性组分含量随吸收剂量的增加呈升高趋势，600～800 kGy范围稍有下降，但无显著差异，1 000 kGy 辐照处理后达到最大值。水溶性组分中低聚木糖含量随吸收剂量的升高显著增加（P＜0.05），1 000 kGy辐照处理后低聚木糖含量为对照的9.63 倍；低聚葡萄糖含量随吸收剂量的升高也呈增加趋势，但增幅远小于低聚木糖；葡萄糖和木糖含量随吸收剂量的变化无明显规律。此外，辐照处理后油茶壳水浸提液pH 值也随吸收剂量的增加逐渐降低。

表2 不同吸收剂量处理对油茶壳木聚糖和水溶性组分含量的影响Table 2 Effects of different absorbed doses on the contents of xylan and water-soluble components in Camellia oleifera shells

2.2 辐照协同水热处理油茶壳制备低聚木糖单因素试验

不同吸收剂量（0～1 000 kGy）处理油茶壳，在固液比（1∶5）～（1∶20）g·mL-1、水热处理温度80～220 ℃反应10～60 min，处理后低聚木糖和木糖的转化率见图1。由图1-A 可知，随着吸收剂量的增加，油茶壳经100 ℃处理30 min，低聚木糖和木糖转化率均呈增加趋势，说明辐照能够促进水热处理过程中油茶壳木聚糖转化为低聚木糖，同时也有部分转化为木糖；当吸收剂量为400 kGy 时，低聚木糖转化率显著增加，比对照提高了32.98个百分点；而吸收剂量从400 kGy增加至1 000 kGy时，低聚木糖转化率仅提高9.51 个百分点，增幅远低于0～400 kGy。温度是影响油茶壳低聚木糖转化率的重要因素（图1-B），随着水热处理温度的升高，低聚木糖转化率呈先升高后降低的趋势，当处理温度为180 ℃时，低聚木糖转化率达到最大值，180～200 ℃处理间低聚木糖转化率无显著差异，220 ℃处理后低聚木糖转化率显著降低；木糖转化率随处理温度的升高呈逐渐增加的趋势，220 ℃处理后木糖转化率显著高于其他处理组，说明提高水热处理温度会促进木聚糖转化为低聚木糖，但温度过高会促进低聚木糖的进一步降解，从而导致转化率降低。不同处理时间对油茶壳低聚木糖和木糖转化率的影响见图1-C，当水热处理时间为0～30 min，油茶壳低聚木糖转化率随反应时间的延长呈显著增加趋势，处理时间为40 min时，低聚木糖转化率达到最大值，但在30～60 min 处理组，油茶壳低聚木糖转化率无显著差异；木糖转化率则随着反应时间的延长逐渐升高。由图1-D可知，当固液比为1∶5 g·mL-1时，油茶壳水热处理低聚木糖转化率为66.47%，低聚木糖浓度达到25.47 g·L-1；随固液比的增加，低聚木糖转化率逐渐升高，这是由于底物浓度低时反应更充分；但固液比（1∶10）～（1∶20）g·mL-1处理间低聚木糖转化率无显著差异。

图2 不同处理对油茶壳低聚木糖和木糖转化率的影响Fig.2 Effects of different treatment on xylo-oligosaccharide and xylose conversion rate of Camelia oleifera shell

2.3 正交试验优化辐照协同水热处理油茶壳制备低聚木糖工艺

γ射线辐照协同水热处理制备油茶壳低聚木糖正交试验结果见表3。极差数据表明，各因素对油茶壳低聚木糖转化率的影响程度依次为吸收剂量（A）＞水热处理温度（B）＞固液比（D）＞水热处理时间（C），最佳处理条件为A2B3C3D2。

表3 γ射线辐照协同水热处理制备低聚木糖L9（43）正交试验结果Table 3 The results of L9（43）orthogonal test for xylo-oligosaccharide prepared by γ ray irradiation combined with hydrothermal treatment

由正交试验得出的低聚木糖转化率最优组合并未包含在表3 中的9 组试验中，因此，以未辐照样品为对照，选取单因素试验最佳条件（A2B2C2D2）、正交试验最优组合（A2B3C3D2）、正交表中最优组（A2B3C1D2）进行验证。结果表明（表4），3组验证试验中A2B3C1D2组低聚木糖转化率最高，比对照提高了22.61 个百分点。因此，最终确定A2B3C1D2为辐照协同水热处理油茶壳制备低聚木糖的最优试验条件，即吸收剂量400 kGy、水热处理温度200 ℃、水热处理时间20 min、固液比1∶10 g·mL-1。

表4 正交试验验证结果Table 4 The verified results for orthogonal test/%

3 讨论

辐照技术用于生物质预处理优势明显，具有操作简便、过程能耗低、不需高温、不污染环境、易于实现产业化等优点。经辐照处理后的木质纤维素类生物质结构变得松散，纤维素和半纤维素糖苷键发生断裂，部分降解形成小分子水溶性聚糖，且辐照对木聚糖的降解作用大于纤维素和木质素［21-22］；武小芬等［23］对辐照后木聚糖样品理化特性和结构进行分析发现，γ 射线辐照处理后的木聚糖表观结构被破坏，聚合度减小、热稳定性降低、反应活化能下降；这些变化均有助于水热处理过程中木聚糖的解聚。本研究发现，随吸收剂量的升高，油茶壳水浸提液pH 值逐渐降低，是由于辐照处理后纤维素、木聚糖和木质素会发生降解产生小分子脂肪酸类物质；同时，这些产物在水热反应过程中可以作为催化剂促进低聚木糖的产生［23-25］。

水热制备低聚木糖的试验中，400 kGy辐照处理的油茶壳低聚木糖转化率比未辐照油样品提高22.61 个百分点；Liu 等［16］采用800 kGy 辐照结合水热处理玉米芯，底物浓度30%、160 ℃反应60 min，低聚木糖浓度超过45.53 g·L-1；这些研究结果表明，辐照是一种有效的预处理手段，能够促进水热处理过程中木聚糖转化为低聚木糖。本试验采用辐照结合水热处理油茶壳制备低聚木糖，转化率最高可达74.33%；Shen 等［26］采用水热处理杨木木屑，180 ℃反应30 min，低聚木糖转化率为53.2%；Zhang等［4］采用苹果酸催化水热处理油茶壳，120 ℃反应30 min，低聚木糖转化率为67.75%；You等［27］采用氯化锌催化水热处理油茶壳，170 ℃反应30 min，低聚木糖转化率为61.38%；这些研究结果说明，采用辐照协同水热处理制备低聚木糖的转化率高于单一水热处理，同时也高于苹果酸和氯化锌等作为催化剂的水热处理。尽管本研究低聚木糖转化率低于Zhang 等［28］采用球磨+超声+水热处理组（80.40%），但辐照处理相对于球磨具有能耗低、噪音小、处理过程相对简便等优点，且文献中水热处理时间为90 min，本研究最佳处理时间仅为20 min，大幅提高了处理效率。

辐照预处理后的油茶壳，水热处理固液比降至1∶5 g·mL-1时，低聚木糖转化率仍保持较高水平（66.47%），而此时处理液中低聚木糖浓度可达25.47 g·L-1，这说明辐照结合水热处理是一种有效的制备低聚木糖的方法。后续将在本试验的基础上，进一步开展不同处理条件下低聚木糖的组成变化研究，探讨木二糖、木三糖和木四糖占总低聚木糖的比例，形成2～4 低聚合度低聚木糖高效制备工艺。同时，还将对低聚木糖分离纯化技术进行研究，开发出高品质的低聚木糖产品。此外，水热处理后油茶壳残渣主要以纤维素和木质素为主，对其进行理化结构分析和产品开发，将有助于推动实现油茶壳资源全组分高值化利用的目标。

4 结论

辐照处理会促进油茶壳中木聚糖的降解，使油茶壳中水溶性组分和低聚木糖含量增加，促进水热处理过程中木聚糖的转化。单因素和正交试验结果表明，辐照协同水热处理油茶壳制备低聚木糖的最佳工艺为吸收剂量400 kGy、水热处理温度200 ℃、水热处理时间20 min、固液比1∶10 g·mL-1，此条件下低聚木糖的转化率为74.33%，比未辐照油茶壳低聚木糖转化率提高22.61 个百分点。可见，相对于传统水热处理技术，采用辐照协同水热处理是制备低聚木糖的有效手段。