Toll样受体4基因单核苷酸多态性与白内障发病的相关性研究

苏丹丹，王春红，夏璐，吴凡

作者单位：皖南医学院第二附属医院眼科，安徽 芜湖241000

年龄相关性白内障（ARC）是最常见的白内障类型，也是全球致盲主要的原因［1-3］。国内外研究均表明，ARC 是环境、代谢、遗传等因素共同作用的结果［4］。单核苷酸多态性（SNPs）是人类基因组中DNA 序列变异及遗传多态性最常见的表现形式，作为一种良好的分子标记，SNPs已成为研究ARC遗传易感性的重要手段［5］。有研究［6］表示，TLR4 可刺激机体释放多种炎性因子，参与原发性开角型青光眼的发生与进展。为研究TLR4 基因的单核苷酸多态性（SNPs，rs4986790 及rs4986791 位点）是否与ARC之间存在关系，我院开展如下研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料将皖南医学院第二附属医院2021年1—12 月收治的100 例白内障病人纳入观察组。纳入标准：病人年龄＞50 岁；最佳矫正视力＜0.5；经晶状体病理及视力检查确诊为白内障。排除标准：青光眼、高度近视、葡萄膜炎及眼部外伤等其他原因引起的白内障者；合并糖尿病、肾脏疾病或全身性疾病及视网膜疾病者。

对照组为年龄、性别与观察组相匹配的86例健康志愿者，其晶状体透明，最佳矫正视力≥0.5，未合并其他眼科疾病。观察组中男53例，女47例，年龄范围为52～85岁，年龄（71.15±13.33）岁，白内障分型：皮质型38例，核型36例，后囊下型13例，混合型13例，对照组中男44例，女42例，年龄范围为51～82岁，年龄（72.63±12.14）岁，两组性别及年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 外周血细胞基因组DNA 制备 采集被研究者外周静脉血4 mL，置于EDTA抗凝管，按照基因组DNA 提取试剂盒（美国Qiagen 公司）相关步骤提取DNA。吸取4 mL血液至15 mL离心管，加入8 mL红细胞裂解液，裂解红细胞，半径10 cm离心机3 000 r∕min 离心10 min，留下管底白细胞团。漩涡震荡30 s，充分分散白细胞团，加入4 mL 白细胞裂解液与40 μL蛋白酶K，再漩涡震荡5 s，放入65 ℃恒温水浴60 min后取出，待其自然冷却至室温后，加入1.5 mL饱和氯化钠溶液，漩涡震荡15 s，半径10 cm、3 000 r∕min 离心10 min，加入4 mL 异丙醇，上下颠倒混匀10～15 次至出现沉淀，室温、半径10 cm、3 000 r∕min离心10 min，去掉上清液，留下管底白色沉淀。加入2 mL 75%乙醇，振荡洗涤沉淀，半径10 cm、3 000 r∕min离心10 min，弃上清液。离心管室温干燥1～2 h，加入200 μL 灭菌双蒸水充分溶解，低温低速离心2 min，将液体集中保存在管底。NANODROP-2000 紫外分光光度仪检测DNA 纯度，OD260∕OD280 为1.7～2.0即符合扩增要求。

1.2.2 SNPs分型 （1）SNPs引物设计：在NCBI网站中找到rs7986790 及rs4986791 的DNA 序列，使用Primer Premier 5 软件设计SNPs 位点的扩增引物及SNaPshot引物，rs7986790正向引物5"-AGACCTGT GGGTGAACCCTA-3"，反向引物5"-GCATTCCCACCTTTGTTGGA-3"，PCR 引 物 长 度 为 474 bp。rs4986791 正向引物5"-CTCTAGAGGGCCTGTGCAATTT-3"，反向引物5"-CTGGACAAGCCATTGAAGATGC-3"，PCR 引物长度为589 bp。（2）PCR 扩增反应体系：2×Es MasterMix（Dye） 5 μL，正、反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水3 μL。（3）PCR 反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，最适退火温度30 s，72 ℃延伸30 s，从第二步到第四步时循环35次，72 ℃延伸5 min，扩增产物放于4 ℃保存。（4）SNaPshot 单碱基延伸测序：PCR 产物纯化后进行SNaPshot单碱基延伸测序，反应体系：PCR纯化产物2 μL，SNaPshot 产物0.2 μL×4，SNaPshot Multiplex 0.5 μL，双蒸水1.7 μL。反应条件：96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，第二步到第四步循环25 次，4 ℃低温备用。（5）二次纯化后上机检测基因型：取4 μL 二次纯化产物，依次加入96 孔板，分别向每孔加入6 μL 双蒸水稀释，启动ABI-3730XL 测序仪，开启完毕后打开软件，设定Cene Mapper 程序，将样品放入测序仪内，采用Gene Mapper 5.0 软件分析。（6）随机挑选观察组与对照组中5%样本进行Sanger 测序，验证采用SNaPshot 单碱基延伸序列法基因分型结果是否准确。

1.2.3 外周血单核细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素（IL）-6 水平检测 （1）分离外周血单个核细胞（PBMC）：抽取被研究者外周静脉血5 mL，置于肝素抗凝离心管内，加入等体积磷酸缓冲液（PBS）混匀，将稀释后的血液加入淋巴细胞分离液表面，保持两者之间的清晰分界，室温下800×g离心25 min，把位于玻璃管中间部位的PBMC 细胞层小心吸出，加入适量PBS洗涤，室温下800×g离心10 min，得到PBMC。（2）制备PBMC上清液。（3）收集PBMC上清液，酶联免疫吸附法（ELISA）检测PBMC 上清液中TNF-α及IL-6水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件处理。计量资料以±s表示，均行正态分布和方差齐性检验，不符合正态分布的变量进行自然对数转化使其成正态或近似正态分布。两组间均数比较采用独立样本t检验，两组TLR4 基因两个多肽位点Hardy-Weinbery 平衡采用χ2检验，基因型个数通过计数方式获得，两组等位基因、基因型频率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Toll 样受体4 基因SNPs 位点等位基因Hardy-Wrinberg 平衡检验Hardy-Weinberg 平衡试验结果提示，观察组及对照组TLR4 基因rs7986790 位点及rs4986791 位点的基因型频率分布实际值与理论值符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，说明吻合度良好（P＞0.05），所纳入的样本具有群体代表性。

2.2 两组Toll 样受体4 基因SNPs 位点等位基因及基因型分布比较两组TLR4 基因rs7986790、rs4986791 位点基因型及其等位基因占比比较均差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 两组Toll样受体4基因SNPs位点等位基因及基因型分布比较∕［n∕N（%）］

2.3 rs7986790 不同基因型病人外周血单个核细胞上清液TNF-α 及IL-6 水平比较rs7986790 基因分型为GA（21 例）及GG（11 例）者PBMC 上清液中TNF-α 及IL-6 水 平［（22.36±4.15）μg∕L、（846.69±179.68）ng∕L］均高于基因型为AA（68例）者［（17.02±2.36）μg∕L、（613.45±163.59）ng∕L］，差异有统计学意义（t=8.19、6.44，均P＜0.001）。

3 讨论

流行病学调查结果提示，遗传因素在ARC中发挥着重要作用，既往研究［7-8］已发现眼发育相关基因、DNA修复相关基因以及转录相关基因等多种基因的SNPs均与ARC之间存在联系。有研究［9-10］在白内障病人房水中检测到TNF-α、IL-6、IL-1β等多种炎性因子。

TLRs是参与连接特异性免疫与非特异性免疫的一类重要的蛋白质分子，广泛表达于中性粒细胞、单核-巨噬细胞等多种免疫细胞［11-12］，是免疫系统中重要的成员，其主要负责识别病原分子与传递信号。TLR4是目前研究最多的TLRs基因，其与恶性肿瘤及自身免疫性疾病的发生间均相关［13-14］。许致玉、张璐［15］研究报道，TLR4基因多态性还与年龄相关黄斑病变有关。TLR4激活后可促进细胞组织纤维化，促进小梁网与细胞外基质结构发生改变；一些全身性免疫系统性疾病如类风湿关节炎、强直性脊柱炎等，TLR4参与这些疾病的发病机制，而全身性免疫性疾病常伴有眼部的炎症，如葡萄膜炎［16-17］。

本研究选取100 例ARC 病人作为观察组，86 例年龄、性别相似，且与ARC病人间无血缘关系的健康者作为对照组，比较发现，两组TLR4基因rs7986790位点基因型及其等位基因占比比较，差异有统计学意义，而两组TLR4 基因rs4986791 位点的基因型及其等位基因占比间差异无统计学意义。其中ARC病人rs7986790 位点GA 及GG 型病人占比均高于健康对照组，提示G基因可能增加ARC病变风险。

对于rs7986790 位点不同基因型的ARC 病人外周血PBMC上清液中TNF-α以及IL-6水平发现，GG+GA基因型病人PBMC上清液中TNF-α以及IL-6水平均高于AA 型基因者。其中TNF-α 主要由单核细胞、巨噬细胞及胸腺依赖淋巴细胞产生，可参与免疫反应［18］，IL-6是一种多效应细胞因子，可调节包括免疫及炎症反应在内的多种生物过程［19］，在正常情况下，TNF-α及IL-6均处于低水平，但在大量组织受到刺激后，以上炎症介质水平将异常升高，引起全身炎症反应［20］。本研究结果提示等位基因G可能通过加重机体炎症反应，促进ARC 的发生。但受限于研究条件与研究设计，本文并未对其中的具体作用机制进行研究，存在一定的局限性。

综上所述，ARC病人TLR4基因rs7986790位点基因型分布与健康者间存在差异，rs7986790位点等位基因G可能通过促进炎症反应，增加ARC患病风险。