高效液相色谱法测定保心宁胶囊中7个指标性成分的含量

巩长芹，卞常芝，毛传伟，孙永喜

（1.临沂市检验检测中心，山东 临沂 276001；2.临沂天源中药饮片有限公司，山东 临沂 276000；3.翔宇药业股份有限公司，山东 临沂 276023）

保心宁胶囊是由丹参干浸膏、当归干浸膏、枳壳干浸膏及三七药材粉末加入生姜水煎浓缩液组成的中药复方胶囊剂，具有活血化瘀，行气止痛之功效，用于心绞痛，心律失常，改善冠心病症状等[1]。其标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十一册，仅有性状、紫外光谱鉴别、化学反应鉴别和检查项，无含量测定项，不能有效控制该产品的内在质量。通过检索文献，发现目前已有对本制剂中的某些成分进行含量测定的报道[2-4]，但不能全面监测本制剂的质量。本文以丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B和丹参酮IIA7个指标性成分为检测目标，进行含量测定，为本制剂的内在质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（配备Agilent 1260四元泵，Agilent 1260 DAD检测器，Agilent四元在线脱气机，Agilent Chemstation工作站），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（美国安捷伦科技公司）；XS 205DU电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（默克公司）。

1.2 药品与试剂

保心宁胶囊（翔宇药业股份有限公司，批号：200201，201001，210301，210302，210303，210901，210902，210903，220101）。丹参素钠对照品（批号：110855-201915，含量以97.8 %计），柚皮苷对照品（批号：110722-202116，含量以93.5%计），橙皮苷对照品（批号：110721-202019，含量以95.3%计），新橙皮苷对照品（批号：111857-201804，含量以99.4 %计），迷迭香酸对照品（批号：111871-202007，含量以98.1%计）、丹酚酸B对照品（批号：111562-201917，含量以96.6 %计），丹参酮IIA对照品（批号：110766-202022，含量以98.9 %计）等均购自中国食品药品检定研究院，均为供含量测定用；甲醇、乙腈均为色谱纯（默克公司），磷酸为色谱纯[阿拉丁试剂（上海）有限公司]，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAXSB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（见表1）；流速；1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：283 nm（0～50 min，检测丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B），270 nm（50～70 min，检测丹参酮IIA）；进样量：10 μl。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取丹参素钠对照品19.12 mg、柚皮苷对照品38.40 mg、橙皮苷对照品10.75 mg、新橙皮苷对照品28.53 mg、迷迭香酸对照品11.19 mg、丹酚酸B对照品29.08 mg、丹参酮IIA对照品11.30 mg，分别置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，均作为各自的对照品储备液。

分别精密量取丹参素钠对照品储备液5 ml、橙皮苷对照品储备液5 ml、迷迭香酸对照品储备液5 ml、丹参酮IIA对照品储备液5 ml、柚皮苷对照品储备液10 ml、丹酚酸B对照品储备液10 ml、新橙皮苷对照品储备液10 ml，置同一50 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，作为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取保心宁胶囊10粒，精密称定内容物重量，混匀，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声（功率300 W，频率40 kHz）提取30 min，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的配制 按保心宁胶囊的处方和工艺要求，分别制备缺少丹参和枳壳的阴性样品，按2.2.2项下方法制成阴性溶液。

2.3 干扰试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液，按2.1项下色谱条件进样分析。结果在供试品色谱图中，呈现与混合对照品保留时间一致的特征峰，阴性溶液未呈现与对照品保留时间一致的特征峰，说明阴性样品对所测组分没有干扰，理论塔板数均大于10 000；7种成分的分离度均大于2.0。色谱图见图1。

图1 干扰试验HPLC图谱

2.4 线性关系

取混合对照品溶液0.2，0.5，1.0，2.5，4.0，5.0 ml，分别置5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列标准溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算回归方程。结果见表2。

表2 回归方程及其范围

2.5 精密度

取2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，进样量为10 μl，记录峰面积。结果丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA峰面积平均值分别为107.6，1030，152.9，922.7，64.37，363.6，215.6，RSD分别为0.73 %，0.59 %，0.71 %，0.47 %，0.88 %，1.19 %，1.03 %，表明仪器精密度较好。

2.6 重复性

分别精密称取同一样品6份（批号：210901），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，进样量为10 μl。结果丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA峰面积平均值分别为106.3，1926，189.1，1830，64.81，636.5，294.3，平均含量分别为1.491，12.035，1.136，10.081，0.991，8.814，1.367 mg/粒；RSD分别为0.57 %，0.68 %，0.56 %，0.86 %，1.13 %，1.07 %，1.23 %，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性

取同一样品（批号：210901）溶液，置室温中，分别在配制后0，2，4，6，8，10，12，24 h，进样分析，进样量为10 μl，记录峰面积。结果丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA峰面积的平均值分别为105.9，1913，187.6，1807，65.67，621.7，289.8，RSD分别为0.27 %，0.49 %，0.57 %，0.90 %，0.94 %，1.67 %，1.09 %，表明供试品溶液24 h内比较稳定。

2.8 加样回收试验

取已知含量的同一样品6份（批号：210901），精密称取0.1 g，置具塞锥形瓶中，每份分别精密加入各对照品储备液，分别为丹参素1 ml、柚皮苷3.5 ml、橙皮苷1 ml、新橙皮苷4 ml、迷迭香酸1 ml、丹酚酸B 3.5 ml、丹参酮IIA1.5 ml，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，进样量为10 μl。结果见表3。结果显示，方法准确度良好。

表3 加样回收试验结果（n=6）

2.9 含量测定

取9 批次保心宁胶囊（批号：200201，201001，210301，210302，210303，210901，210902，210903，220101），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，进样量为10 μl，记录各峰面积，按外标法计算含量，结果见表4。

表4 含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 波长的选择

对丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮IIA7种成分在190～400 nm进行DAD全波长扫描，得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3种成分在283 nm、丹参素在280 nm、迷迭香酸和丹酚酸B在286 nm、丹参酮IIA在270 nm处各有最大吸收，但丹参素、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B 6种成分的最大吸收波长相差无几，在283 nm处均有明显吸收，因此选择283 nm作为此6种成分的测定波长，选择270 nm作为丹参酮IIA测定波长。

3.2 流动相的选择

参考《中国药典》和相关文献[5-15]，确定采用梯度洗脱模式，并对流动相进行筛选，包括乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.4 %磷酸溶液、乙腈-0.2 %磷酸溶液、乙腈-20 %乙腈溶液（溶剂为含0.08 %十二烷基硫酸钠的2.4 %冰醋酸）、甲醇-0.2 %甲酸溶液，结果以乙腈-0.1 %磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，7种成分峰形好，各峰分离度高，阴性样品没有干扰。

3.3 提取条件的选择

参考相关文献[2-21]，考察了50 %甲醇、70 %甲醇、甲醇、50 %乙醇、乙醇作为提取溶剂，以及提取溶剂的不同用量（20，25，50，100 ml）对提取效果的影响，结果用50 ml甲醇作为提取溶剂，提取率最高；考察了超声时间（20，30，45，60 min）对提取率的影响，结果发现加入50 ml甲醇超声处理30 min之后，测得的结果相差很小，故选择加入50 ml甲醇超声处理30 min提取样品。