非洲猪瘟发病机理研究进展

冯芳兰

（甘肃省畜牧技术推广总站，甘肃 兰州 730030）

非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）是猪的一种急性、热性、高接触性传染病，已被证明对全球猪肉行业造成破坏性影响。20世纪20年代，在肯尼亚引进欧洲家猪后，该病首次被发现[1]，之后ASF病毒蔓延到全球各地，影响着猪产业的健康发展。非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一种直径为200 nm的二十面体DNA病毒，包括包膜、衣壳、内囊膜、核壳和内核。病毒基因组是一个长度为170～190 kb的线性双链DNA分子，两端共价闭合。根据病毒株的不同，编码150～200种病毒蛋白，包括68种结构蛋白和100多种非结构蛋白[2-5]。ASFV基因组中某些序列的重复和丢失是导致不同来源或同一品系的世代ASFV菌株差异的因素之一[6]。p72是ASFV主要的衣壳蛋白，因其保守性而用于血清分型。单核-巨噬细胞是ASFV的主要靶细胞[7]。ASFV感染宿主细胞的分子机制尚不清楚。网格蛋白依赖的内吞途径和大细胞吞噬途径是ASFV侵袭的可能途径。然而介导这一过程的细胞膜受体和病毒蛋白仍然未知。截至目前，仍然没有有效的疫苗或抗病毒药物来预防或治疗非洲猪瘟。复杂的病毒基因组及其调节宿主免疫反应的能力可能是开发疫苗困难的原因。

1 ASFV感染机制

病毒成功感染宿主细胞必须经历6个过程，包括吸附、渗透、脱衣、生物合成、包装和脱落。ASFV在与宿主受体结合后或通过巨噬细胞增多途径被内化。病毒粒子在感染1～30 min时进入早期核内体，并在30～90 min运输到晚期核内体。之后，ASFV完成了晚期核内体的脱壳和基因组释放。基因表达可分为3个阶段：早期、中期和晚期。早期基因表达发生在感染后的4～6 h，主要编码ASFV复制相关蛋白，随后在感染后的6～8 h复制ASFV基因组。基因组复制首先发生在细胞核中（主要在细胞质），复制后，编码病毒颗粒结构相关蛋白的中晚期基因在8～16 h开始表达。在16～24 h，病毒颗粒在病毒工厂聚集。大约24 h后，组装好的病毒颗粒从细胞膜上发芽，释放到细胞外[8]。单核巨噬细胞是ASFV的主要宿主细胞。此外，ASFV还感染次要靶细胞，如血管内皮细胞、肝细胞或上皮细胞[9]。

2 ASFV入侵机制

研究表明，ASFV进入宿主细胞是一种受体介导的内吞过程，依赖于温度、能量、胆固醇和低pH值，相关研究将这一过程描述为网格蛋白依赖的内吞作用（CME）和巨胞饮作用。CME和巨胞饮作用都需要动力素。几种药物抑制剂和特异性蛋白对ASFV进入所需的抑制关键蛋白具有明显的负作用，表明ASFV进入的主要途径是巨胞饮作用。巨胞饮作用依赖于肌动蛋白的重排，还涉及胆固醇、钠/质子交换器（Na/H）、EGFR、PKC、磷酸化PI3K、Pak1激酶和小Rho-GTPase Rac1的激活[10]。但在一些研究中，纯化的病毒颗粒在Vero细胞和巨噬细胞中没有引起显著的巨胞饮作用[11]。临床症状提示ASFV感染的巨噬细胞表现出抗体依赖性增强作用（ADE），也就是说，Fc受体可能参与该过程，但需要进一步的研究来验证这个假设[12]。抗体依赖性增强作用说明ASFV更喜欢利用不同的途径来提高其感染各种靶细胞的能力，并适应感染过程中不断变化的条件。

3 ASFV在宿主细胞中的传播机制

病毒粒子从早期核内体到病毒工厂再到细胞膜的运输取决于微管的功能[13]。病毒粒子内化后，囊泡在细胞中依次形成早期核内体（EE）、成熟核内体（ME）和晚期核内体（LE）。随着含ASFV的EEs成熟为LEs，核内体腔逐渐酸化，核内体膜表面的分子标记物逐渐改变，最终在酸性环境中病毒颗粒脱壳。ASFV感染会重新分布整个囊泡系统，因此病毒颗粒可以很容易地被运输到核周区[14]。感染早期，衣壳蛋白和内包膜蛋白立即与特定标记物共同定位，如EE和大粒细胞体中的EEA1和Rab5。感染晚期，病毒内包膜蛋白（p17）或核壳蛋白（p150）与晚期内体标记物（Rab7）和溶酶体标记物（Lamp1）共同定位，后者是ASFV感染的关键调节因子[15-19]。病毒颗粒在病毒工厂（VF）中组装后，驱动蛋白使用多端微管马达将“货物”从病毒工厂运输到细胞膜。此外，ASFV还可以通过过度乙酰化微管来增加微管的稳定性，以确保成熟的病毒颗粒被运输到质膜上。肌动蛋白细胞骨架被认为是病毒逆行运输的一种可能的替代途径[20]。

4 ASFV在宿主细胞中的复制及基因表达机制

ASFV从核内体释放出来，通过病毒内膜蛋白pE183L（p54）结合微管动力蛋白激活微管系统，迁移到核周微管组织中进行DNA复制和生物合成[21-25]。病毒基因的表达分为4个阶段：即刻、早期、中期和晚期。早期基因在病毒感染的4～6 h表达，包括病毒基因组复制所需的蛋白质和酶，晚期基因的表达与免疫逃避的多基因家族相关。ASFV感染6～8 h后，病毒开始复制。虽然ASFV的复制主要发生在细胞质的VF中，但在早期的细胞核中也有短暂的复制时刻。8～16 h后，中晚期基因开始表达，合成形成新生病毒所需的结构蛋白和包装在病毒颗粒中的早期转录因子[26]。通过质谱分析，共有68种病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其是病毒转录、DNA修复和蛋白质修饰不可或缺的重要组成部分[27]。

5 ASFV病毒工厂形成机制

ASFV劫持并改变细胞反式高尔基体核内体网络系统以促进病毒感染。宿主适配器蛋白AP-1介导蛋白质从trans-Golgi网络（TGN）到核内体的转运，吸收网格蛋白形成网格蛋白包被的小泡，通过识别蛋白质分选信号进行选择性转运。AP-1在小GTP酶ADP核糖基化因子1（Arf1）的调控下被招募到TNG膜。细胞内AP-1定位和细胞内网格蛋白包被的体/核内体迁移由于外包膜蛋白CD2v和AP-1之间的相互作用，可诱导新的膜结构形成[28]。

相关研究表明，各种形式和小型的ASFV膜碎片的结构和功能参与病毒工厂形成的早期过程，先形成弯曲的膜，再形成组装中间产物。这些膜的组装中间体积累和聚集形成网络结构[29]。病毒工厂是存在于微管组织中心（MTOC）[30]的单个并且比较大的核周结构，病毒在这里完成复制以及新合成病毒体的组装。病毒工厂膜结构中存在结构蛋白p54和p34，共聚焦显微镜显示病毒工厂中的p72和p54在形态上是不同的，p72为点状结构，而p54为多态结构，可能是p54与新形成的病毒颗粒之间的连接有关[31]。ASFV感染会改变细胞内胆固醇的分布[32]。胆固醇对细胞的摄入是病毒进入宿主细胞、复制和形成病毒工厂的关键。相反，胆固醇不允许在核内体积聚，否则病毒颗粒将滞留在核内体。大量的脂质转移蛋白，如羟甾醇结合蛋白（OSBP），介导病毒工厂中的脂质和离子交换。病毒利用膜接触位点（MCS）确保脂质转移到病毒工厂[33-34]。病毒颗粒招募PI4P激酶形成大量的PI4P聚集体，然后聚集PI4P蛋白形成大量MCS，MCS通过胆固醇和PI4P交换积累胆固醇。此外，在ASFV感染细胞的室颤中发现了完成脂质交换和磷脂酰肌醇-4激酶β（PI4Kβ）所需的含有ACBD3的酰基辅酶A结合域。研究表明，ASFV编码的g5Rp具有1个Nudix水解基序，该基序可能在调节病毒形态中起作用，涉及二磷酸肌醇多磷酸盐介导的膜转运[35]。ASFV j4R蛋白与新生多肽相关复合体（NAC）的α链相互作用，这表明j4R可能参与新合成蛋白向病毒工厂的转运[36]。完整的病毒工厂是缺乏外部限制膜的单个结构，由线粒体和波形蛋白包围，其提供病毒工厂的物理支架或阻止病毒进入细胞质[37-38]。病毒感染期间病毒工厂的形态发生变化。由于病毒工厂形成，宿主细胞的重排机制以及病毒工厂与宿主细胞膜的关系仍不清楚[39]。

6 ASFV免疫调节机制

ASFV感染猪巨噬细胞后，宿主首先诱导先天性免疫反应，然后产生适应性免疫反应[40]。ASFV的基因组是DNA，这可能被cGAS（DNA的一种模式识别受体）识别为病原体相关分子模式（PAMP），然后通过cGAS/STING信号通路激活I型IFN的表达。I型干扰素的下游抗病毒基因，如IFIT家族也被激活和表达。I型干扰素和干扰素刺激基因（ISG）可以抵抗ASFV感染。巨噬细胞和树突状细胞是ASFV感染诱导的自然免疫应答的主要效应细胞。巨噬细胞能够释放一系列细胞因子，如IL-1a、IL-1b和IL-18，并表达MHCI以启动适应性免疫反应。浆细胞样DC（pDC）和自然杀伤细胞（NK）可以产生大量干扰素来抵抗ASFV感染。ASFV感染8 d后，抗体水平逐渐升高，这表明宿主存在体液免疫应答。这些中和抗体有一定的保护作用。此外，细胞免疫，如CD8+T细胞，在ASFV感染中也起着重要的抗病毒作用。CD4+CD8+双阳性T细胞可分泌穿孔素和颗粒酶，这也可能在抵抗ASFV感染中发挥作用[41]。然而，为了生存并产生后代病毒，亲本病毒编码各种蛋白质以逃避宿主的免疫反应。

迄今为止，还没有针对ASFV的有效疫苗，这使得ASF的预防或控制变得困难。因此，ASFV的基础研究仍需为疫苗研究提供理论依据。一方面，ASFV在宿主细胞中的生命周期需要进一步研究；另一方面，宿主对ASFV的免疫应答以及ASFV进化的免疫抑制机制有待进一步研究。虽然ASFV感染细胞的详细过程在以往的研究中已被描述，但涉及的细胞和病毒蛋白仍是未知的。可能有多个分子作为受体或共受体参与病毒感染过程。参与进入宿主细胞的病毒蛋白可作为ASFV衰减的靶点，这为成功开发疫苗提供了可能性。ASFV成功进入宿主细胞后，在核周区附近形成VF，这是新生病毒组装所必需的。然而，VF膜结构的形成机理尚不清楚。此外，ASFV也在细胞核内复制，ASFV DNA进入细胞核可能与可以进入细胞核的病毒蛋白p37、p14和p10有关[42]。然而，病毒蛋白介导的大病毒DNA到细胞核的转运、DNA复制和DNA到细胞质的转运有待进一步研究。众所周知，ASFV入侵机体会产生一系列抗病毒反应，而ASFV也能形成自身的免疫逃逸机制对抗抗病毒反应。此外，一些ASFV基因还可以通过抑制转录因子（如IRF3和NFkB）抑制巨噬细胞I型IFN的产生。ASFV的免疫侵袭和免疫抑制机制已部分阐明，但仍不清楚。ASFV通常以几种方式抑制某些抗病毒蛋白或免疫反应的表达。如A276R、I329L通过不同机制抑制IFN-b的表达，A179L、A224L、DP71L抑制细胞凋亡。这种冗余可能也是疫苗开发困难的原因之一。因此，研究ASFV编码蛋白的功能，特别是介导ASFV免疫逃逸和免疫抑制的蛋白，对ASFV减毒活疫苗的开发和设计具有重要意义。