ceRNA网络在哺乳动物卵泡和早期胚胎发育中的研究进程

任 颖，杨小耿，孙美媛，张慧珠1,，兰道亮，李 键，何翃闳*

（1.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点试验室，四川 成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点试验室，四川 成都 610041；3.西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

近年来，随着基因测序技术的不断发展，有研究发现circRNA存在于哺乳动物的胎盘和胚胎中[1]，甚至在某些物种的卵丘细胞和卵母细胞中广泛存在。迄今为止，人们已发现数百种不同的circRNA[2-3]，其对哺乳动物生殖发育过程的调控作用也有所不同。哺乳动物的卵泡发育是一个高度复杂且受到多方面因素调控的精密过程[4]，在整个生理过程中，卵泡的发育会受到环境中各类因素的影响。大量研究发现，circRNA、miRNA和mRNA三者在卵泡和早期胚胎发育过程中存在串扰关系。circRNA作为一种非编码RNA，可以充当ceRNA，构成circRNA-miRNA-mRNA网络（ceRNA网络），并通过该网络发挥其调控作用[5-6]，从而介导卵泡成熟过程中的相关信息通路以及参与调控早期胚胎的发育。因此，ceRNA网络在哺乳动物繁殖领域发挥着更为重要的作用[7]。然而，目前国内外关于circRNA的研究主要集中于其在不同组织中的表达规律以及在疾病发展过程中发挥的重要调控作用等方面，缺乏对ceRNA网络在哺乳动物繁殖领域潜在功能的深入探索[8]。本文主要梳理ceRNA网络在哺乳动物卵泡和早期胚胎发育过程中产生的作用，为进一步研究ceRNA网络在哺乳动物繁殖方面的潜在功能寻找新方向。

1 ceRNA网络概述

1.1 circRNA

circRNA是一类特殊的非编码RNA，由反向剪切产生，不存在5'和3'端，呈现封闭环状结构，不受RNA外切酶的影响，表达稳定，不易降解[9]。大部分circRNAs主要存在于细胞质中，由外显子环化形成；少部分circRNAs主要存在于细胞核中，由内含子环化或者外显子和内含子共同环化形成。circRNA上含丰富的miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，可以与miRNA结合，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用。部分miRNA与某些生理过程相关，circRNA通过与miRNA之间的相互联系在这些生理过程中起到重要作用[10]，但是如果考虑circRNA靶点数量问题，也有研究表明circRNA大多数很可能不是标准的miRNA海绵，其会在一个更大的调控网络中发挥重要作用，这也为ceRNA网络的深入调查提供了背景。

1.2 miRNA

m i R N A 是研究最多的一类非编码R N A 分子，它是参与转录后基因调控的小ssRNA分子（18～23 nt）[11]。miRNA的生物发生是从初级miRNA转录物的转录开始，由Drosha酶和Dicer酶加工为成熟的miRNA后，再被整合到RISC复合体中，与某些mRNA的3’UTR区域进行结合，最终导致mRNA降解或翻译受阻[12]。此外，一个miRNA可以靶向多个mRNA，一个mRNA可能包含多个miRNA的靶位点，这导致mRNA-miRNA网络可能在转录后基因调控和细胞生理学过程中发挥重要作用，也为发现ceRNA网络的其他功能奠定了基础。

1.3 ceRNA网络串扰机制

ceRNA是一类独特非编码RNA，能够与mRNA竞争以结合相同的miRNA[13]，构成ceRNA网络，其揭示了RNA间相互调控的新机制。研究发现，ceRNA网络在多种生理过程中广泛存在，如ceRNA有长链非编码RNA、circRNA、假基因、人工合成miRNA抑制剂及病毒miRNA抑制剂等。当circRNA充当ceRNA与mRNA竞争结合miRNA时，三者之间相互作用成为ceRNA串扰，但是一个miRNA可串扰多个不同circRNA和mRNAs，所以一个miRNA参与多个不同串扰，而由同一个miRNA介导的串扰，形成一个ceRNA网络[14]。

2 ceRNA网络在哺乳动物卵泡发育过程中的作用

2.1 circRNA调控生殖激素的合成

下丘脑和垂体是调节生殖相关激素分泌的关键内分泌器官[15]。哺乳动物下丘脑在一定条件下会释放促性腺激素释放激素，作用于腺垂体，使得垂体释放出2种促性腺激素（促卵泡激素和促黄体激素，FSH和LH）进入血液循环，促进性腺中配子体结合和类固醇发生。有研究通过KEGG通路的分析表明，在高产量和低产量黑山羊卵泡期多种非编码RNA（ncRNA）表达功能的比较中，发现circRNAs参与了与垂体功能直接相关的信号通路[16]，包括TGF-β信号通路[17]、MAPK信号通路[18]和FOXO信号通路[19]，其中MAPK8、MAPK1、BRAF和MAD1L1在孕激素介导的山羊垂体卵母细胞成熟过程中富集[20]，MAPK8、ADCY9、SRC、PLCB1和SOS2在GnRH信号通路中富集；在高产量和低产量黑山羊黄体期ncRNA表达功能的比较中，发现差异表达circRNA（Differential expression circRNA，DEcircRNA）主要参与GnRH信号通路、雌激素信号通路和催乳素信号通路，其中GNAO1、ADCY9、SRC、PLCB1和SOS2在雌激素信号通路中富集。由此可知，circRNA主要富集于促性腺激素释放激素信号通路，通过ceRNA网络调控相关生殖激素的合成，这些激素的产生对于介导卵母细胞成熟以及哺乳动物早期胚胎发育具有重要作用。

2.2 ceRNA网络参与调节哺乳动物卵泡成熟与闭锁

大量研究结果表明，circRNA参与山羊、猪、鼠等哺乳动物的卵泡发育过程[21-23]。chi_circ_0031209和chi_circ_0019448可以在黄体期通过影响高产和低产山羊泌乳素受体的表达而在繁殖中发挥重要作用；chi_circ_0014542则在卵泡期参与调控WNT5A的表达[16]，进而调控哺乳动物的卵泡发育。此外，有研究通过深度测序和生物信息学分析，分别在哺乳动物卵丘细胞和卵母细胞中鉴定了7 067个和637个circRNA。其中，DE circRNA的宿主基因显著富集于与卵丘细胞功能和卵母细胞成熟相关的多种信号通路，分析表明circRNA的一个派系在特定的发育阶段以特殊的方式进行发育，并通过这种形式差异表达，试验发现了这一派系中母源表达的circARMC4，并认为其是卵母细胞减数分裂成熟和发育的重要调节因子[20]，这一派系中结构相似的其他circRNA的功能值得探索。有学者将101个miRNAs与哺乳动物卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的功能性miRNAs进行比较，确定了16个功能性miRNAs，验证了卵泡闭锁过程中存在miRNA-circRNA的相互关系，并且在其中发挥作用[24]。由此可知，ceRNA网络参与卵泡闭锁相关过程。还有研究结果表明circRNA在猪卵巢卵泡中广泛存在，其主要参与猪卵泡的发育过程，并在卵泡闭锁过程中具有调控作用，让circINHA作为ceRNA竞争性结合miR-10a-5p用来上调CTGF表达以调控猪颗粒细胞的凋亡[25]。此外，有研究发现宿主基因主要参与激素分泌、颗粒细胞凋亡和卵泡发育[26]，而circRNA作为lncRNA的一种，其是否有相同的作用还有待研究。上述研究结果也提示哺乳动物卵巢卵泡闭锁过程中存在ceRNA网络的潜在调控。

3 ceRNA网络在哺乳动物早期胚胎发育中的作用

附植前胚胎的发育是生殖过程的重要环节之一，哺乳动物早期发育过程伴随着细胞的增殖、迁移以及细胞命运的层级特化，在整个发育过程中受到母体内多方面因素的影响[27]。其中，circRNA-miRNA-mRNA网络对早期胚胎发育过程的影响已经逐渐吸引研究者的目光[28]。

有研究通过高通量测序系统分析SSC和FGSC的circRNA和lncRNA表达谱，比较两性生殖干细胞中circRNA和lncRNA表达的共同点和不同点，通过差异分析，得到性别特异性表达的921个circRNA和2 331个lncRNA。对这些性别特异性表达的circRNA和lncRNA靶基因或hosting基因的GO和Pathway分析，揭示了circRNA和lncRNA通过调控激素分泌和基因印记维持生殖干细胞向不同类型配子发育的潜能[29]，进而提高两性配子结合成功率，为早期胚胎形成提供物质基础。也有研究对奶山羊发情期和发情间期卵巢组织中circRNA表达谱进行检测和分析，结果表明奶山羊卵巢组织中circRNA的表达水平因奶山羊发情的不同生理阶段而不同，circRNAs可通过ceRNA网络影响卵巢发育相关信号通路，导致卵巢中卵泡发育和早期胚胎发育过程发生变化[30-31]，可为研究哺乳动物繁殖领域早期胚胎的发育奠定基础。综上所述，鉴于circRNA的保守性及其不同种类的功能仍在研究中，可以假设其他哺乳动物繁殖过程中也广泛存在类似的circRNA，并且可以通过ceRNA网络的构建以及多基因对比等方式继续探索circRNA在哺乳动物生殖领域的潜在功能。

4 展望

随着高通量测序技术的不断发展，circRNA逐渐由无用的剪切废料变成了相关研究的主要内容。越来越多ceRNA网络的发现使得哺乳动物生殖领域被不断探索并见证。除了已发现的作用机制外，是否存在其他调控机制也尚未可知，现如今对于circRNA的研究大多局限于转录组学方面，在未来如果可以多角度进行多组学整合研究，可能会发现其他非常有价值的circRNA调控机制，circRNA-miRNA-mRNA网络也会成为探索circRNA在生殖细胞和胚胎发育过程中发挥作用的重要手段，为哺乳动物繁殖方面的研究打开新视角。