α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI影响病毒毒力的分子机制

庞玉莲,秦旭东,汪铭书,程安春

α疱疹病毒(Alphaherpesvirus)是一类重要的人兽共患病病原,包括可以感染人的水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)以及感染动物的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)等。目前已经被鉴定的囊膜糖蛋白有12种,包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM与gN,其中gI与gE形成异源二聚体(gE/gI),参与病毒的二次囊膜包被过程,促进病毒在细胞间的传播,也在病毒逃避宿主免疫中起着重要作用。

囊膜糖蛋白gI由US7基因编码,属于典型的Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外域、跨膜区及胞内域组成[1]。在对gI功能的探究中,发现gI对于α疱疹病毒的复制不是必需的,但在病毒毒力方面起着重要的作用,VZV、HSV-1、PRV、DPV等gI缺失突变病毒的毒力均会出现不同程度的下降[2-10];而另一方面发现gI和gE序列的改变可能是引起PRV毒力增强的原因之一[11-12]。本文将对α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI影响病毒的毒力机制做简要的介绍,旨在为后续深入探究此蛋白功能的相关研究及α疱疹病毒引起的相关疾病的防控提供理论参考。

1 gI参与病毒粒子的装配与转运过程影响病毒毒力

α疱疹病毒的病毒粒子结构相似,由双链DNA、衣壳、皮层和囊膜4个部分组成。病毒在感染时通过膜蛋白吸附在细胞膜上,进而细胞膜与囊膜融合,由皮层包裹的病毒核衣壳进入细胞质内,通过微管转移至细胞核处[13];再与核孔相互作用将病毒核酸注入细胞核[14];随后病毒DNA开始复制并与核内的病毒衣壳蛋白形成核衣壳,组装好的核衣壳被内核膜包裹进入核周隙完成初级包膜[15];完成初级包膜的病毒粒子与外核膜融合后进入细胞质(去包膜),形成裸露的核衣壳,随后在胞质内获得大量皮层蛋白,并在细胞内膜进行病毒二次囊膜包被,在胞质囊泡内形成完整病毒粒子[16];这些胞质囊泡与细胞膜发生融合或通过胞吐作用使病毒粒子释放到细胞外[17-18]。在病毒粒子形成过程中,gI与gE形成gE/gI复合物,参与病毒在高尔基体反面网状结构(Trans-Golgi network,TGN)的二次囊膜包被过程,促进病毒粒子的成熟;在感染后期,gE/gI会转移到细胞连接处,促进病毒粒子的传播。病毒粒子的成熟和传播对于病毒感染都是不可或缺的,因此,gI可通过这两个过程进而影响病毒的毒力。

1.1 gI参与病毒粒子二次囊膜包被过程影响病毒毒力 在体外培养中,Mallory等发现gI对于VZV的复制不是必需的,但gI的突变会扰乱合胞体的形成以及改变gE的构象和分布,进而减少感染性病毒粒子的释放[19]。这与Wang等关于gI对病毒复制影响的结论一致,当VZV gI缺失C端或者N端后,受感染细胞的TGN会形成膜性堆积,使得病毒粒子不能转运到高尔基体,病毒二次囊膜包被过程被破坏,完整病毒粒子的合成受阻[7]。VZV完全缺失gI后,会造成病毒粒子在黑色素瘤细胞内的复制延迟及释放受阻,并且在感染免疫缺陷小鼠异种移植的人背根神经节(Dorsal root ganglia,DRGs)时,小鼠神经症状相对轻微、缓慢且不能持续,在感染14 d后,病毒的拷贝数降低了100倍[20];同样缺失gI的VZV也不能在皮肤及T细胞异种移植中顺利复制[8]。说明gI对于完整病毒粒子的形成具有重要作用。

Farnworth等人使用细胞表面蛋白的生物素标记和特异性抗体的方法证明了HSV gE/gI从细胞膜上内吞并积聚在较大的囊泡中[21],gE利用gI成熟的氨基末端在内质网间隙形成复合物,并在内质网释放后定位在高尔基体,通过gE胞内域与细胞分选机制的相互作用促进病毒的二次囊膜包被过程(图1C)[22]。gI的内吞作用主要是通过其胞质尾区的双亮氨酸基序与细胞的内吞机制直接作用介导的[23],并且依赖于gE/gI复合物的形成,当单独表达gI时,gI蛋白会在细胞膜表面积累,而不能被内化至胞内[24];此外,VZV gI的内吞基序还可以增强gE从质膜中寻找和转运病毒粒子组分到囊膜包被位点的能力[25]。HSV gE/gI 在感染的早期阶段通过上述过程特异性定位于TGN,与多种皮层蛋白相互作用,选择性招募病毒粒子的结构成分,促进病毒囊膜蛋白以及皮层蛋白的聚集,胞吞至TGN完成二次囊膜包被[26]。gI的缺失会引起gE/gI复合物形成受阻,病毒粒子二次囊膜包被过程受到影响,不完整的病毒粒子在高尔基体处堆积,导致无法高效形成具有侵袭力的病毒粒子,从而影响病毒毒力。

注:1.gE/gI作为Fc段受体结合IgG的Fc段(右图B),其他病毒膜蛋白(gD)结合IgG的Fab段形成复合物(右图A),这两种复合物在细胞表面被内吞到初级内体(early endosomes,EE);2.被内吞的复合物到达分选内体(sorting endosomes,SE);3.在酸性条件下IgG与gE/gI解离,IgG与gD形成的复合物经溶酶体途 径(lysosomal pathway,Lys)进行降解;4.游离的gE/gI经再循环内体(recycling endosomes,RE)重新分布到细胞表面或逆行到TGN再回到RE;5.gE/gI参与病毒粒子在TGN的二次囊膜包被过程;6.gE/gI将完成包被过程的病毒粒子分选至细胞连接处,经与细胞表面受体的相互作用,病毒粒子完成向未感染细胞的移动。

1.2 gI参与病毒粒子的转运影响病毒毒力 胞间传播是α疱疹病毒扩大感染的一个重要过程,病毒粒子通过粘膜或眼上皮组织(HSV)或皮肤(VZV)以及突触连接的神经元网络迅速传播,gI与gE形成的复合物对这种传播有及其重要的作用。α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI与gE 含有酪氨酸和双亮氨酸基序以及酸性和磷酸化的氨基酸簇[27],当gI与gE形成复合物后,这些基序通过类似于受体介导的内吞作用结合到TGN,通过gE的C末端结构域(CT)的酪氨酸基序与衔接蛋白(Adapter protein,AP)相互作用,将包膜病毒粒子特异性地分选到具有细胞连接的基底外侧表面[28-29]。在缺失gE的CT结构域后,新包膜的病毒粒子被定向至细胞顶端表面,导致病毒粒子传播至相邻细胞的过程受阻[30-32]。在病毒感染后期,gE/gI重新分布到细胞外侧表面,通过受体机制定位在细胞连接处,其胞外域与相邻细胞受体结合(如钙调蛋白)来促进病毒颗粒从受感染细胞向邻近未受感染细胞的跨连接移动(图1C)[33]。此外,gE/gI复合物的形成还会促进形成合胞体,而缺失或突变gI后,合胞体形成受阻,因此gI的完整表达,对病毒传播过程中有效的膜融合是非常重要的[34]。

VZV gE/gI的形成还有利于gE的结构稳定,将VZV gE胞外域第一个富含半胱氨酸的区域缺失,阻止gI与gE结合后,会改变gE在受感染细胞膜上的表达,影响gE的成熟以及其与病毒粒子的结合[10],但缺失gI不会影响病毒粒子形态和gE包装到病毒粒子[35]。例如在感染了缺失gI的VZV的细胞中,gE在细胞表面表达减少,不规则的膜结构和液泡堆积在细胞质中,病毒粒子向细胞表面的出口发生改变[7,23]。Zerboni等也发现缺失gI的VZV在神经细胞中,细胞膜上的gE含量很低,gE会在粗面内质网滞留以及高尔基体会发生扭曲[20]。这些提示着异常的gE细胞内转运可能与gI缺失后的病毒感染能力下降有关。

综上,gI作为α疱疹病毒囊膜糖蛋白在与gE形成gE/gI复合物后,参与病毒粒子的二次囊膜包被以及将病毒粒子正确分选到细胞连接处,并促进相邻细胞的感染。gI的正确表达有助于gE/gI在细胞连接处正常发挥其功能,从而促进病毒在细胞间的高效传播[36]。

2 gI囊膜糖蛋白参与病毒在神经轴突的运输过程而影响病毒毒力

α疱疹病毒如HSV-1、VZV和PRV,表现出一种感染动物宿主中枢神经系统(Central nervous system,CNS)和外周神经系统(Peripheral nervous system,PNS)的倾向[37]。病毒在感染上皮细胞后,到达PNS的神经元轴突末梢,逆行转运进入神经元胞体,在此处沉积基因组并建立潜伏感染[38-39]。成功建立潜伏感染后的病毒再次激活时会在神经元胞体中进行复制,产生的病毒颗粒在微管上沿着胞体到轴突末端的方向进行快速顺行轴突运输,回到受神经支配的上皮组织,从而发生潜伏感染再激活[40]。顺行运输过程依赖于轴突的分拣,运输的对象可能为完全组装的病毒粒子或无包膜的核衣壳[41-42]。在潜伏感染再激活过程当中,在神经元胞体合成的病毒成分经轴突顺行运输是病毒感染受神经支配的组织所必需的[43]。目前关于α疱疹病毒在神经元轴突顺行运输共提出两种模型,其中“匹配模型”认为病毒与其他细胞中组装过程一样,在进行轴突运输前已经完成二次囊膜包被[44];而“分离模型”认为病毒粒子的二次囊膜包被发生在轴突运输之后,未获得囊膜的核衣壳和病毒糖蛋白分别在轴突上被分选和运输,最后在轴突末端进行组装[45-46]。现有研究结果表明,α疱疹病毒感染后的组装过程比较符合匹配模型(尤其是PRV的顺行转运过程),但有些证据表明分离模型也可能存在[47-50]。

α疱疹病毒粒子在神经元中的轴突定向传导机制是其完整生命周期的重要组成部分,但是目前对这种传导机制了解甚少。α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI是一个重要的神经毒力基因,已有的研究表明,gI对于α疱疹病毒神经毒力至关重要,gI缺失后,α疱疹病毒的神经致病性有不同程度的减弱[11]。缺失gI的PRV对易感动物的神经致病性会显著减弱[51];兔子通过鼻内感染gI缺失的牛疱疹病毒5型(Bovine herpesvirus type 5,BHV-5),其神经症状出现明显减弱(2～4倍)[52],而在同时缺失gE和US9后神经症状进一步减弱[53];gI缺失突变后的马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus type 1,EHV-1)在大鼠脑内的感染能力极度减弱,在加入PRV的gI蛋白后能恢复突变病毒对视顶盖的入侵[54];具有TK、gE和gI缺陷的PRV变异株无明显神经症状,具有开发成新一代疫苗的潜力[55]。

在对疱疹病毒神经毒力的探究中发现,gI主要通过影响病毒粒子在神经元轴突的顺行转运过程影响病毒毒力。根据McGraw等的研究结果,在缺失gI的情况下,小鼠神经元中的HSV-1病毒粒子顺行转运过程受阻,病毒粒子不能顺利进入下一个神经元[56];Oliver等将gE和gI蛋白的第一个富含半胱氨酸的区域突变后,发现VZV在DRGs上的传导受到影响,且gI缺失的VZV突变株在皮肤和T细胞上的感染性丧失[10];另有研究表明VZV gI在神经元细胞中进行复制期间可以促进病毒体组分进入轴突,且在病毒建立潜伏感染过程中是必需的[57-58];PRV强毒株(Becker株)与缺失gE和gI基因的弱毒株(Bathar-K61株)相比,两个毒株在神经轴突中的传导能力具有明显的差异,Becker株在神经轴突中能正常双向传导,而Bartha-K61株仅能单向传导,Bartha-K61株接种小鼠的存活时间明显延长,且临床症状不明显[59]。以上研究表明,α疱疹病毒中gI是一个重要的神经毒力基因,可通过其胞质结构域影响病毒在神经轴突上的传播进而影响其神经毒力,并且gI的胞质结构域比gE的胞质结构域更能促进病毒的传播[60],但其作用的具体机制还有待研究。

在神经模型研究中,微丝和微管骨架在α疱疹病毒感染过程中起着非常重要的作用,病毒粒子可通过驱动蛋白沿着微管进行移动完成运输过程。PRV病毒粒子与驱动蛋白家族成员1A(Kinesin family member 1A,KIF1A)在原代大鼠颈上神经节神经元轴突内共转运,KIF1A的过表达和敲低分别增加和减少了顺行衣壳转运,而KIF1A可以与US9共同纯化[61],两者之间可能存在某种相互作用。缺失gE/gI后,含有绿色荧光蛋白标记US9的病毒粒子在胞体中组装,但不能有效地分拣到轴突中[62],这说明gE/gI间接促进或稳定US9蛋白与KIF1A之间的相互作用,使病毒核衣壳及其他蛋白分选至神经轴突中进行顺行转运。在进一步缺失US9后,病毒粒子仍可组装完成,但是顺向运输的病毒粒子却急剧较少,这与gE/gI/US9复合物缺失后不能募集KIF1A有关[63-65]。在神经元中进行复制时,PRV gE/gI和US9组成的复合物聚集在TGN上,随后复合物与KIF1A发生交联,介导轴突分选和顺行轴突转运,将病毒粒子从神经元胞体运输到轴突末端[63];一旦病毒粒子进入轴突,gE/gI与US9的结合能力将会降低,US9在轴突生长锥中参与病毒释放,但是,不管是在PRV感染或过表达的情况下,gI都会在后期促进蛋白酶体降解KIF1A,因此,病毒粒子分选至轴突的时间是非常有限的[66-68](图2)。缺失gI后,KIF1A介导的PRV的顺行转运速度明显降低[69],这可能是由于gI的缺失破坏了gI/gE-US9复合物的完整性,并且PRV gI的CT区缺失突变体在轴突的转运效率明显低于野生株[65],因此gI的CT区是PRV顺行转运所必需的,US9可能通过该区域与gE/gI形成三元复合物,这也进一步说明了gI对于稳定该复合物的重要性。在对其他α疱疹病毒的研究中,利用免疫荧光对病毒糖蛋白和衣壳蛋白在神经元细胞中的定位分析发现,VZV gI在潜伏感染再激活中的作用是促进轴突对于病毒粒子结构成分的获取[58];在HSV-1感染的神经元中,含有gE/gI与US9的TGN可以作为HSV-1病毒粒子装载到微管上的平台,gE/gI与US9在此促进衣壳和含糖蛋白的囊泡装载到驱动蛋白上,驱动蛋白将HSV-1的结构成分运送到轴突末端[66,70]。但HSV-1 US9与KIF1A未见相互作用的报道,把HSV-1 US9引入到缺失US9的PRV中时,发现HSV-1 US9不会与KIF1A结合,可能有其他驱动蛋白与之结合[67]。

注:在神经元胞体中,gE/gI与US9在TGN形成复合物,随后与KIF1A发生交联,介导轴突分选以及轴突转运,促进病毒粒子运输到轴突末端,而在HSV中US9可能与其他驱动蛋白结合。

α疱疹病毒在潜伏感染再激活后经轴突顺行运输至上皮组织是其扩大感染的前提,而gI在这个过程中起着非常重要的作用。缺乏gI的α疱疹病毒在感染宿主时,对神经系统的侵袭能力明显减弱,并且潜伏感染再激活状态缓慢,表明gI是病毒神经毒力的关键基因,其机制可能为缺失gI后的病毒粒子不能有效的进行轴突运输或者进行高效的感染性病毒粒子合成。

3 囊膜糖蛋白gI参与病毒免疫逃逸而增强病毒毒力

宿主被病毒感染后,会立即启动先天性免疫应答,增强固有免疫细胞的活性以及诱导固有免疫分子的产生进而抑制病毒的感染,其中I型干扰素的产生可以诱导细胞产生抗病毒蛋白,使细胞处于抗病毒状态,抑制病毒的增殖[71]。此外,特异性免疫应答在抗病毒感染过程中起着关键的作用,然而病毒已经进化出多种逃避宿主免疫功能的策略,例如,可以通过靶向补体蛋白、NK细胞、MHC I类和MHC II类分子、抑制NF-κB的活性以及抗体生成等方式来对抗机体免疫,有助于病毒的持续感染[72-73]。囊膜糖蛋白gI作为α疱疹病毒粒子表面的抗原决定簇,具有一定的免疫原性和表达量,参与病毒免疫逃逸的过程。

3.1 参与病毒逃避宿主的体液免疫反应 在HSV-1、PRV和VZV感染的细胞中,gE/gI可以作为Fc受体与IgG的Fc段结合,进而影响IgG Fc段与补体以及拥有Fc受体的NK细胞和单核/巨噬细胞的结合,抑制经典补体激活通路的激活或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),干扰抗病毒免疫反应以增强病毒持续感染的能力[74-75]。

HSV-1 IgG Fc受体是通过gI的第128-145位氨基酸与gE相互作用形成,gE与gI之间以1∶1的方式形成复合物,复合物再以1∶1的方式结合IgG(图1B),gE/gI复合物既能与IgG聚集体结合,又能与IgG单体结合,但gE单独表达时只能结合低亲和力的IgG聚集体,只有与gI共表达时才能结合高亲和力的IgG单体[76]。Friedman等[73]通过体外研究证实抗HSV的IgG通过Fab结构域与靶抗原结合,而gE/gI与IgG Fc末端结合,形成抗体双极桥结构(图1A),可以抑制体内和体外免疫球蛋白池中75%的IgG,也可抑制IgG Fc域激活补体。基于该结构,可以推测gE/gI在细胞表面进行内吞时将通过Fc结构域结合的IgG以及相关病毒抗原蛋白共同带入细胞内,该复合物通过初级内体运输至溶酶体,而gE/gI有较强的pH依赖性,只在碱性条件下与IgG结合,所以在酸性的溶酶体中,gE/gI与IgG解离,通过再循环内体被运输至细胞表面或TGN,溶酶体中的IgG和抗原蛋白则被降解或回收,gE/gI以此消除IgG和细胞表面抗原,阻断了Fc结构域的作用,逃避宿主的免疫作用,此功能可能在免疫动物体内重新激活病毒过程至关重要(图1C)[77-78]。同样,在PRV 中gE/gI Fc受体活性有助于保护PRV感染单核细胞免受体外高效ADCC的侵袭,同时gE/gI的特异性抗体可以部分干扰PRV gE/gI与IgG的高效结合[74]。

3.2 降低宿主体内干扰素生成 干扰素是宿主细胞在病原体感染后产生的一种抗病毒细胞因子,作为抗病毒感染的第一道防线,对于抗病毒感染有重要意义,其中I型干扰素在抗病毒感染中起重要作用。I型干扰素,IFN-α和IFN-β的不同表达不但依赖于细胞类型,还依赖于细胞内的转录因子以及病毒刺激。病毒感染时通过不同的途径诱导干扰素的产生,取决于病毒进入、细胞取向、感染剂量以及宿主状态等因素。诱导产生的IFN可以通过激活潜在的抗病毒基因的表达使细胞产生一种抗病毒状态,例如,鹅IFN-α及IFN-γ可以有效降低DPV在鸭胚成纤维细胞上的感染[79]。在PRV感染过程中,缺失gI和gE会引起宿主IFN-α的表达显著增加,已有研究表明gE/gI通过调控细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)的信号传导,减少ERK1/2磷酸化,进而抑制浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid d endritic cells,pDC)中IFN-α的产生,gE/gI是目前发现的第一个抑制pDC活性的α疱疹病毒因子[4,80]。

4 结语与展望

囊膜糖蛋白gI参与α疱疹病毒的组装及传播,与病毒在宿主体内的免疫逃逸以及神经轴突的运输过程也密切相关。gI基因对于α疱疹病毒的胞间传播是必需的,但关于其作用的具体机制的研究还较为匮乏,目前研究较为清楚的是gI可以与gE形成gE/gI复合物并作为Fc受体与IgG结合,帮助病毒逃逸宿主免疫,但关于gI参与其他免疫逃逸途径的机制还未见更多的报道;疱疹病毒gI蛋白在神经系统上的研究主要是通过细胞模型,以动物为模型未见较深入的机制研究。疱疹病毒初次感染后,可以在宿主的神经节内建立潜伏感染,在潜伏感染期间病毒仅表达极少量的基因且不进行复制,这极大程度上避免了被宿主免疫系统清除,使用现有疫苗来抵抗潜伏感染也不能起到良好的控制效果,如何减轻或消除疱疹病毒潜伏感染可以作为疫苗研发的重点。gI蛋白在神经中的功能主要是参与病毒粒子的轴突顺行运输,这与潜伏感染再激活密切相关,通过对gI在神经轴突运输机制的研究,以阻止病毒的重新激活为新的抗病毒策略,可以为研发更加安全高效的疫苗提供参考,因此对于gI介导的病毒毒力机制的研究,可作为未来一个重要方向。

利益冲突：无