肠易激综合征关键基因的筛选及验证

朱文娟,周 菲,费素娟

(1徐州医科大学第一临床医学院消化内镜重点实验室,徐州 221004;2徐州医科大学附属医院消化内科;*通讯作者,E-mail：xyfyfeisj99@163.com)

随着社会经济发展,肠-脑互动紊乱性疾病IBS等的发病比例增加,成为消化专科的巨大临床挑战[1,2]。肠-脑互动机制研究揭示：特定脑区的炎症反应和功能改变与肠道微环境变化和肠黏膜屏障功能损伤是互为因果的核心机制[3]。应激是引发肠脑互动特定脑区炎症反应和功能改变的重要因素,其中涉及下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)[4]、免疫系统[5]和脑-肠-微生物轴[6]等多条途径。肠黏膜屏障损伤即“微肠漏”,是肠腔微环境中的条件致病因素与宿主防御机制之间攻防紊乱致不同程度肠黏膜炎症,可影响特定脑区功能性或病理性改变,使内脏高敏感效应增强[7]。精神应激与“微肠漏”互为因果关系[8],在精神应激致特定脑区高耗能状态下,更易遭受“微肠漏”打击,引发炎症等病理改变,加剧功能异常。结合中枢神经系统疾病研究锁定,小胶质细胞是促发特定脑区炎症的关键[9]。但应激和肠黏膜屏障损伤引发特定脑区炎症反应的机制并不明确,可干预的分子靶点也未锁定。本研究通过公共基因表达谱数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中IBS患者及健康对照者的直肠结肠活检样本、十二指肠空肠活检样本的芯片检测结果进行分析,并利用皮质酮(corticosterone,Cort)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、Cort叠加LPS构建应激、炎症、应激叠加炎症的小胶质细胞模型来模拟IBS的发生发展,验证DEGs在IBS中的表达,旨在研究参与IBS发生的关键通路/基因,进一步了解IBS的发生机制。

1 材料与方法

1.1 表达谱数据来源,数据处理及标准化

设定“irritable bowel syndrome”或“IBS”为检索关键词,“Homo sapiens”为研究对象,“Expression profiling by array”为研究类型,从中选取近年且数据集包含样本量较大的数据集GSE36701和GSE166869。GSE36701数据集包含221例样本,选取其中IBS患者直肠结肠活检样本87例,健康对照直肠结肠活检样本40例。GSE166869数据集包含69例样本,选取其中IBS患者十二指肠空肠活检样本43例,健康对照十二指肠空肠活检样本26例。从GEO数据库下载经过预处理、标准化及log2转化的基因探针表达矩阵,通过探针号和Gene symbol的依次对应,去除没有对应到Gene symbol的探针,当1个基因由多个探针匹配时,采用中位数进行替换,进一步得到表达谱数据集的基因样本信息。基因表达矩阵需要进一步完成标准化步骤以消除样本之间差异,通过Sangerbox软件(http：//sangerbox.com/Tool)中的数据处理工具对基因表达矩阵完成分位数标准化,从而得到标准化后基因表达矩阵。

1.2 DEGs筛选

用R语言limma软件包对GSE166869和GSE36701数据集进行IBSvsHC基因表达差异分析,所有基因经过分析后得到相应的P值,选取差异表达阈值P<0.05且|log2FC|>0.263的基因作为DEGs。对2个数据集差异基因取交集用于后续分析。用R语言的软件包ggplot2、ggpubr、ggthemes、pheatmap对DEGs分别以火山图和热图形式进行可视化呈现。

1.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)

GSEA是判断基因集在不同生物状态中是否具有统计学意义、一致性差异的。把GSE36701和GSE166869的标准化基因表达矩阵文件和样本分组文件引入Sangerbox软件GSEA简易分析工具,样本分类包括IBS组和HC组,背景数据库选用的是KEGG数据库。软件按照算法计算富集分数(ES),标准富集分数(NES),标准化的显著性水平,纠正多重假设检验。

1.4 基因本体论(gene ontology,GO)和KEGG分析

GO分析提供不同生物基因功能的信息,可研究DEGs功能及特性。GO包括：细胞组件(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物学过程(biological process,BP)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用于细胞通路的预测。将DEGs输入到富集分析工具g：profiler(https：//biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)中进行GO和KEGG富集分析,数据来源设定为GO cellular component, GO molecular function, GO biological process和KEGG,分析标准设定为调整后P<0.05。

1.5 PPI网络和关键基因的筛选

交互式基因恢复工具(STRING)可评估功能基因组学数据。将DEGs导入STRING(http：string-db.org/)数据库进行分析。选择的物种是homo sapiens,筛选combined score>0.4的蛋白,导入Cytascape软件并构建PPI网络。运用CitoHubba插件,根据Degree算法,筛选关键基因(hub genes)。

1.6 上调的DEGs与疾病、药物的相关分析

将上调的共有差异表达基因分别导入基因富集分析工具WebGestalt中的Disgenet(https：//www.disgenet.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)数据库,通过ORA富集方法分析,设定P<0.05为富集结果。

1.7 细胞与分组处理

细胞及主要试剂：BV2神经小胶质细胞及细胞专用培养基购于武汉普诺赛生物科技有限公司,脂多糖、皮质酮均购于上海麦克林生化科技有限公司,一抗(Pellino-1、SHARPIN、TLR4、NF-κB p65、IκBα、TNF-α、IL-1β)均购于英国Abcam公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒、Trizol均购于上海碧云天生物技术有限公司,TNF-α、IL-6、CRP ELISA试剂盒均购于武汉云克隆科技股份有限公司,PCR引物由徐州伟沃生物科技有限公司合成。

本研究分为正常对照组、LPS组、Crot组、LPS+Cort组。正常对照组在80%～90%融合度的BV2神经小胶质细胞中加入适当体积培养基,LPS组和Cort组加入分别含1 μg/ml LPS、50 nmol/L Cort的同体积培养基刺激4～6 h。LPS+Cort组加入同时含1 μg/ml LPS和50 nmol/L Cort的同体积培养基刺激4～6 h。每组设置3个复孔,进行3次独立重复实验。

1.8 实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的表达

收集处理后的各组细胞,用Trizol提取总RNA,分离mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增目的基因,计算ΔCt值,以2-ΔΔCt法分析处理。反应条件：95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,共40个循环。引物序列如下：GABRE上游引物为5′-CTTCAATGTAAGCAGGAGG-3′,下游引物为5′-GATAGGAGACACGAGGGA-3′;MICALL2上游引物为5′-TCACGCCGCAAGAAACTA-3′,下游引物为5′-CAAGGTCATTGTCCAGGATT-3′;TLR4上游引物为5′-AGCTCCTGACCTTGGTCTTG-3′,下游引物为5′-CGCAGGGGAACTCAATGAGG-3′;NF-κB p65上游引物为5′-ACTGCCGGGATGGCTACTAT-3′,下游引物为5′-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3′;IκBα上游引物为5′-GGTCTCGCTCCTGTTGAAGTGTG-3′,下游引物为5′-TCCGTGTCATAGCTCTCCTCATCC-3′;TNF-α上游引物为5′-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3′,下游引物为5′-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′;IL-1β上游引物为5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′,下游引物为5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′。每组设置3个复孔,进行3次独立重复实验。

1.9 免疫印迹法(Western blot)检测GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表达

向处理后的细胞中加入RIPA裂解液,提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。配制7.5% SDS-PAGE进行凝胶电泳,蛋白上样量为10 μg,70 V恒压电泳2 h,湿转法400 mA恒流快速电转160 min,将蛋白转至PVDF膜上,3% BSA封闭液封闭2 h。将蛋白质条带分别加入抗GABRE(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、TNF-α(1∶800)、IL-1β(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)一抗中,4 ℃摇床过夜,使用TBST洗涤。条带放入与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)中孵育1 h,TBST洗涤。暗室中化学发光显影。每组设置3个复孔,进行3次独立重复实验。

1.10 ELISA实验检测TNF-α、IL-6和CRP的表达

取处理后的细胞上清离心,设置标准品孔和样本孔,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体37 ℃水浴锅温育60 min。弃去液体,吸水纸上拍干,重复洗板5次,加入底物A、B后37 ℃避光孵育15 min。加入终止液在450 nm波长处测定各孔的OD值。每组设置3个复孔,进行3次独立重复实验。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 DEGs筛选结果

根据|log2FC|>0.263,P<0.05的筛选标准,GSE36701中IBS组与HC组有861个DEGs,包含447个上调基因和414个下调基因;GSE166869中IBS组与HC组有4 426个DEGs,包含117个上调基因和4 309个下调基因(见图1,2)。GSE36701和GSE166869的交集基因有95个,其中均上调的基因有4个,均下调的基因有62个(见图3)。

A. GSE36701中差异表达基因热图B. GSE166869中差异表达基因热图图2 IBS组与HC组差异表达基因热图Figure 2 Heat map of differentially expressed genes between IBS group and HC group

A.两数据集差异基因的交集 B.两数据集上调差异基因的交集C.两数据集下调差异基因的交集图3 GSE36701和GSE166869的IBS组与HC组差异表达基因情况Figure 3 Differential expression of genes between IBS group and HC group in GSE36701 and GSE166869

2.2 GSEA分析结果

设定P<0.05为标准筛选,GSE36701中差异表达基因富集到帕金森病、甲状腺癌、卵母细胞减数分裂和亨廷顿病(见图4)。GSE166869中差异表达基因富集到P53信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用、细胞周期、n聚糖生物合成、阿尔茨海默病、错配修复、TOLL样受体信号通路、NOD样受体信号通路、细胞凋亡等,设定P<0.01为富集结果筛选,取前10个富集结果进行可视化呈现(见图5)。

图4 GSE36701中IBS组与HC组差异表达基因的GSEA分析图Figure 4 GSEA analysis of differentially expressed genes between IBS group and HC group in GSE36701

2.3 GO分析和KEGG分析结果

GSE36701和GSE166869中的共有差异表达基因GO分析结果为：①在生物学过程中,主要富集于自然杀伤细胞介导的细胞毒性调节、自然杀伤细胞介导的免疫调节、胞内运输的调节、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、自然杀伤细胞介导的免疫、白细胞介导的细胞毒性调节、蛋白激酶a信号、细胞杀伤、细胞杀伤的调节、咽弓动脉形态发生等。②在细胞组件中,主要富集于3级颗粒腔、微绒毛、树突膜、纺锤体、3级颗粒、神经元投影膜、特异颗粒腔、循环内吞体、中体、线粒体外膜等。③在分子功能中,主要富集于核纤层蛋白结合、氨基酰基转移酶活性、MHC蛋白复合物结合、组蛋白脱乙酰酶结合、碳水化合物结合、E-box结合、蛋白激酶a结合、半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性、分子功能激活剂活性、线性酰胺中作用于碳-氮(而非肽)键的水解酶活性等(见图6)。KEGG分析结果示共有差异表达基因显著富集于疟疾、人T细胞白血病病毒1型感染、细胞周期、乙型肝炎、药物代谢-细胞色素p450、细胞色素p450外源生物代谢、EB病毒感染、结直肠癌、γ-氨基丁酸能突触等通路(见图7)。设定P<0.05为标准筛选,取前10个GO富集分析结果及KEGG分析结果进行可视化呈现。

图5 GSE166869中IBS组与HC组差异表达基因的GSEA分析图Figure 5 GSEA analysis of differentially expressed genes between IBS group and HC group in GSE166869

图6 IBS组与HC组的共有差异表达基因GO分析结果Figure 6 GO analysis results of common differentially expressed genes in between IBS group and HC group

图7 IBS组与HC组的共有差异表达基因KEGG分析结果Figure 7 KEGG analysis results of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

2.4 PPI网络和关键基因的筛选

通过STRING数据库构建GSE36701和GSE166869中的共有差异表达基因的PPI网络(见图8)。结果显示中枢节点最高(即关键基因)的为CDC20、PTTG1、BIRC5、CDKN3、MYC、HIST1H2AJ、NUSAP1、HIST1H2AB、HIST1H2AE、HIST1H3C、HIST1H3B(见表1及图9)。

2.5 GSE36701和GSE166869中共有上调差异表达基因与疾病、药物分析结果

设定P<0.05为标准筛选,GSE36701和GSE166869中共有上调差异表达基因与疾病关系预测有13种疾病,前10名为：聋盲症、原发性震颤、手术中休克、脉络膜疾病、中暑、丛集性头痛、虹膜疾病、食欲亢进、贪食症、分裂情感障碍(见表2)。GSE36701和GSE166869中共有上调差异表达基因与药物关系预测有10种药物,分别为：氟马西尼、氟硝西泮、戊巴比妥、异氟醚、苦味毒、丙泊酚、抗焦虑药、四氢孕酮、乙醇、核黄素(见表3)。

图8 IBS组与HC组的共有差异表达基因的PPI网络Figure 8 PPI network of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

表1 IBS组与HC组的共有差异表达基因的前11个关键基因信息

图9 IBS组与HC组的共有差异表达基因的前11个关键基因Figure 9 Top 11 hub genes of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

表2 IBS组与HC组共有上调差异表达基因与疾病关系预测

2.6 Cort和LPS对GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达的影响

qRT-PCR检测发现Cort组、LPS组和LPS+Cort组小胶质细胞中GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表达显著高于正常对照组,且LPS+Cort组表达显著高于Cort组和LPS组(见图10)。

表3 IBS组与HC组的共有上调差异表达基因与药物预测

与正常对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与LPS+Cort组相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001图10 qRT-PCR检测Cort和LPS对细胞中GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的影响Figure 10 Effect of Cort and LPS on GABRE,MICALL2,TLR4,IκBα,NF-κB p65,TNF-α,IL-1βin cells detected by qRT-PCR

2.7 Cort和LPS对GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达的影响

免疫印迹法结果发现Cort组、LPS组和LPS+Cort组细胞中GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表达显著高于正常对照组,且LPS+Cort组表达显著高于Cort组和LPS组(见图11)。

2.8 Cort和LPS对细胞中TNF-α、IL-6、CRP的影响

ELISA检测结果发现Cort组、LPS组和LPS+Cort组细胞中TNF-α、IL-6和CRP的表达显著高于正常对照组,且LPS+Cort组表达显著高于Cort组和LPS组(见图12)。

与正常对照组相比,***P<0.001;与LPS组和Cort组相比,###P<0.001图11 Western blot检测Cort和LPS对细胞中GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β蛋白的影响Figure 11 Effect of Cort and LPS on GABRE,TLR4,IκBα,NF-κB p65,TNF-α,IL-1βin cells detected by Western blot

与正常对照组相比,***P<0.001;与LPS组和Cort组相比,###P<0.001图12 ELISA检测Cort和LPS对细胞中TNF-α、IL-6、CRP的影响Figure 12 Effect of Cort and LPS on TNF-α,IL-6,CRP in cells detected by ELISA

3 讨论

IBS是常见的胃肠道疾病,影响全球数百万人。尽管IBS普遍存在,但机制尚不完全清楚,而脑-肠轴在IBS中发挥重要作用。有关研究表明帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病患者的肠道微生物群落改变,致肠黏膜、血脑屏障功能受损,使大脑积累肠道内源性毒物和代谢物,引起脑区炎症,造成肠脑互动异常[10]。本研究以在GEO公共数据库中筛选出的IBS相关芯片结果作为研究对象,筛选出差异表达基因,通过取交集得到共有的差异表达基因,对共有差异表达基因的GSEA分析结果显示,IBS与帕金森病、阿尔茨海默病等相关,并可激活TOLL样受体信号通路。

肠上皮细胞的紧密连接是维持肠黏膜屏障的结构和功能完整性所必需的。小肠微绒毛的变化会引起肠道通透性的改变。研究发现,肠道黏膜受损致通透性增加致“微肠漏”,可促进消化道来源的炎症活性物质激发特定脑区的炎症反应[11],是中枢神经系统疾病(如阿尔兹海默症等)的发病机制之一[12,13],可进一步造成肠脑互动紊乱。本研究GO分析结果显示IBS患者与健康人群共有差异表达基因可能通过影响微绒毛的结构发挥作用。KEGG通路分析结果示共有差异表达基因显著富集于药物代谢-细胞色素p450、γ-氨基丁酸能突触等通路。IBS会造成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其受体通过γ-氨基丁酸能突触等途径形成相应变化。细胞色素p450可影响抗精神病等药物代谢,或可作为肠脑互动紊乱的相关治疗靶点。

我们又进一步对共有差异表达基因进行蛋白互作分析,筛选IBS相关的关键基因,其中CDC20、PTTG1、BIRC5、CDKN3、MYC、NUSAP1等均与肿瘤的发生发展相关。有研究证实IBS患者与健康人群相比不会增加患肿瘤的总体风险,且IBS与较低的结直肠癌死亡率相关[10]。原因可能是IBS患者更倾向于结肠镜检查,可早期发现结直肠癌前病变等,更早地干预治疗,降低IBS患者发生癌症的风险。

与此同时,我们又对共有上调差异表达基因与疾病、药物进行预测分析,发现共有上调差异表达基因与食欲亢进、分裂情感障碍等相关,证实了DEGs在肠-脑互动异常疾病中发挥重要作用。共有上调差异表达基因与药物预测中相关的药物是氟硝西泮、抗焦虑药等。在早期研究已表明IBS患者有精神心理异常,焦虑和抑郁症状突出。抗焦虑药治疗后可改善IBS患者精神障碍,减轻腹痛等症状[14]。

进一步表明了精神心理因素参与IBS的发生发展,因此抗焦虑药等是治疗IBS的重要手段。

IBS患者与健康人群共有差异表达基因中有4个上调基因,其中GABRE是GABA受体,可参与IBS的病理生理过程[15],便秘型IBS患者血清中GABA减少,且下降程度与临床症状相关。用含谷氨酸脱羧酶(GABA合成途径中的限速酶)的益生菌治疗,可缓解IBS患者腹痛症状,改善抑郁程度[16,17]。GABA是神经抑制性递质,可改善精神紧张,起到抗焦虑、镇静作用,IBS患者中GABA减少,与其受体GABRE结合减少,游离GABRE增加,进一步加剧IBS患者的临床症状。MICALL2主要在神经系统和肌肉中表达,可影响多动症等精神疾病的临床症状的发展[18],在一定程度上影响肠-脑互动,推进IBS发生发展。

临床实践证明,精神心理应激和肠黏膜低度炎症是诱发或加重IBS症状的重要因素,因此,本研究利用LPS、Cort、LPS+Cort构建炎症、应激、炎症叠加应激的小胶质细胞模型,以此来模拟IBS的发生发展。本研究结果发现,应激或炎症作用下GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达上调,且应激叠加炎症处理时有放大的炎症反应。相关生物信息学分析表明GABRE基因可激活NF-κB通路[19],引起炎症反应。本研究亦验证了GABRE基因可通过NF-κB通路促发细胞炎症反应。应激状态下下丘脑通过HPA轴促进肾上腺皮质释放Cort,Cort的过度累积可诱导脑区炎症反应,释放TNF-α、IL-1β等炎症因子,启动小胶质细胞内炎症信号[20]。同时,应激可改变肠道微生物组成,使菌群多样性下降。并且,应激增加血脑屏障通透性,提高了细胞因子和肠道微生物代谢产物进入大脑的机会,扩大脑区的炎症反应[21],使肠脑互动异常,加剧IBS进展。

GABRE、MICALL2基因与IBS发生发展相关,是IBS治疗的潜在靶标。IBS发病机制受多种因素影响,部分基因在IBS中有关键作用。但是,大多数基因的功能及对IBS的确切作用仍不清楚,因此需要更多研究来确定这些基因的作用机制及基因之间的相互作用。